کاربردSYBR GREEN در بررسی­های مولکولی

پيام بهزادي-عضو هيات علمی گروه ميکروب ­شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس

الهام بهزادي-گروه ميکروب ­شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس

مقدمه

SYBR GREEN از جمله رنگ­های درخشانی است که با مولکول­های دو رشته­ ای DNA، پيوند بسياراختصاصی برقرار می نمايد. اين گروه از رنگ­ها کاربرد زيادی داشته و در بررسی­ های مولکولی جهت تعيين ميزان مولکول­های دو رشته ­ای DNA در Real-Time PCR و مشاهده­ ی مولکول­های دو رشته ­ای DNA در ژل الکتروفورز (ژل آگارز و ژل پلی­آکريل آميد) مورد استفاده قرار می­ گيرد. رنگ­های مصنوعی SYBR GREEN نخستين بار از اوايل دهه­ ی 1990 ميلادی (برابر با دهه­ ی 1360 خورشيدی) توليد و روانه­ ی بازار شد. به­ طورکلی، SYBR GREEN يک رنگ نامتقارن سيانينی است و سيانين­ها خانواده­ایی از رنگ­های آلی مصنوعی هستند که در عکاسی، ساخت CD و DVD و پژوهش­های مولکولی مورد استفاده قرار می ­گيرند.

به ­تدريج، SYBR GREEN I جايگزين رنگ درخشان Ethidium Bromide خواهد شد، زيرا ميزان جهش ­زايي آن بسيار کمتر بوده و در عين حال دفع ترکيبات آغشته به آن فاقد مشکلات مربوط به رنگ Ethidium Bromide است، اما بايستی توجه داشت هر ماده ­ای که قابليت پيوند شدن با مولکول DNA را داشته باشد، به­ عنوان يک ترکيب سرطان­زا تلقی می­ گردد. 

ويژگی­ها

گروه رنگ­های SYBR GREEN در گستره­ ی دمايي وسيعی پايدار بوده و به همين دليل می­ توان از آن برای نشان دادن واکنش­های بيوشيميايي مختلف در دماهای بالا و پايين استفاده کرد. به­ علاوه، رنگ­های مزبور با سطح مولکول DNA پيوند غيرکووالانسی برقرار می­ نمايند؛ از اين­رو SYBR GREEN در فعاليت های بسياری از آنزيم­های نوکلئاز و DNA­ پلی­مراز هيچ­ گونه تداخلی را اعمال نمی­ کند.

از ويژگی­های استثنايي SYBER GREEN توانايي پيوند آن با ميزان بالايي از مولکول­های DNA می ­باشد؛ به ­همين دليل است که استفاده از چنين رنگی می ­تواند در تعيين ميزان دقيق DNA در Real-Time PCR کمک زيادی نمايد.

همچنين، از آنجايي ­که رنگ­های SYBR GREEN 25 بار حساس­تر از رنگ Ethidium Bromide می ­باشند، بنابراين اگر ميزان نمونه­ ی مورد بررسی اندک هم باشد به ­خوبی قابل مشاهده است که اين خود يکی از امتيازات ويژه­ ی اين گروه از رنگ­ها می­ باشد .

رنگ SYBR GREEN I، علاوه بر اين­که قابليت پيوند با مولکول­های دو رشته­ ای DNA را داراست می­ تواند به مولکول­های RNA نيز متصل شود، اما ميزان درخشش رنگ، کمتر خواهد بود. اين ويژگی برای مطالعاتی که هدفشان مشاهده­ ی پديده ­ی آپوپتوزيز می ­باشد بسيار منحصر به ­فرد می ­باشد، زيرا مولکول­های RNA کم­رنگ بوده و مولکول­های دو رشته­ ای DNA که دچار آپوپتوزيز شده­ اند، کاملا پر رنگ خواهند بود.

در بررسی­های به عمل آمده مشخص شده است که ميزان درخشش کمپلکس DNA-SYBR GREEN I 5 بار بيشتر از کمپلکس DNA-Ethidium Bromide می­ باشد.

برای پر رنگ شدن مولکول­های RNA بايستی از رنگ SYBR GREEN II استفاده نمود.

مزايای استفاده از SYBR GREEN:

1-  رنگ حاصل از درخشش SYBR GREEN سبز بوده که معمولا” برای محصولات بدست آمده از PCR کاربرد فراوان دارد. دامنه ­ی رنگی SYBR GREEN از زرد به سبز پر رنگ درخشان است که اين ويژگی برای بررسی ميزان محصولات PCR بسيار اهميت دارد.

2-  رنگ SYBER GREEN زمينه­ ی ژل آگارز و يا پلی­ آکريل آميد را به مانند Ethidium Bromide رنگی نمی­ کند که از ويژگی­های مهم SYBR GREEN می ­باشد، زيرا اگر اندکی غلظت رنگ زمينه­ ی ژل ( اين مطلب در مورد رنگ Ethidium Bromide صادق است) افزايش يابد، ديگر باندهای ايجاد شده توسط مولکول­های دو رشته ­ای DNA به خوبی قابل مشاهده نيستند.

3-  از رنگ SYBR GREEN می ­توان برای رنگ­ آميزی مجدد ژل رنگ شده با Ethidium Bromide استفاده نمود، زيرا باعث رويت بهتر باندها می­ شود و اين مسئله بسيار مطلوب است.

4-  در هنگام مشاهده ­ی ژل­های رنگ شده با SYBR GREEN به کمک UV transilluminator، اگر ميزان مولکول­های DNA تک رشته ­ای در ژل زياد باشد، رنگ مربوطه بيشتر به سمت نارنجی درخشان تمايل دارد تا سبز.

5-  چنانچه، پيوسته از Ethidium Bromide برای رنگ نمودن ژل استفاده شود و ظرف مربوطه به خوبی شسته و يا تميز نگردد، استفاده­ ی دوباره از رنگ SYBR GREEN در همان ظرف، سبب ايجاد باندهای نارنجی درخشان مي­ شود و نه رنگ سبز.

6-  می ­توان بيش از 99% از رنگ SYBR GREEN I که به مولکول­های دو رشته­ ای DNA متصل شده ­اند را با کمک اتانول جدا نمود.

با توجه به مطالب بيان شده به نظر می­ رسد که در آينده­ ای نه­ چندان دور، رنگ­های خانواده­ ی SYBR GREEN کاملا” جايگزين رنگ Ethidium Bromide می ­گردد. در واقع، مانعی که تاکنون بر سر راه استفاده­ ی همه جانبه از رنگ SYBR GREEN بوده، هزينه­ ی بالای اين رنگ می ­باشد. نويسندگان مقاله­ ی حاضر نيز با توجه به تجربه ­ای که از هر دو رنگ داشته­ اند، استفاده از SYBR GREEN را بجای Ethidium Bromide توصيه می ­نمايند.

منابع:

SYBR® Green I Nucleic Acid Gel Stain, Molecular Probes, Inc.http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp07567.pdf, 2006.1)

2)SYBR GREEN I Nucleic Acid Gel Stain, www.roche-applied-science.com/, 2005

3)SYBR Nucleic Acid Gel Stains, http://www.invitrogen.com/, 2003

 Updegraff E., What is SYBR

®?, http://www.wisegeek.com/what-is-sybr-green.htm, 2003-2010.

4)Updegraff E., What is SYBR Gree

5)SYBR Green I, http://en.wikipedia.org/wiki/SYBR_Green_I, 07.22.2010.