کاربردSYBR GREEN در بررسی­های مولکولی

پيام بهزادي-عضو هيات علمی گروه ميکروب ­شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس

الهام بهزادي-گروه ميکروب ­شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس

مقدمه

رنگ SYBR GREEN یکی از رنگ‌های درخشان است که با مولکول‌های دو رشته‌ای DNA پیوندی بسیار اختصاصی برقرار می‌کند. پژوهشگران این رنگ را در بررسی‌های مولکولی به‌کار می‌برند و با کمک آن میزان DNA دو رشته‌ای را در Real-Time PCR تعیین می‌کنند. همچنین پژوهشگران از این رنگ برای مشاهده DNA دو رشته‌ای در ژل الکتروفورز مانند ژل آگارز و پلی‌آکریل‌آمید استفاده می‌کنند.

دانشمندان از اوایل دهه ۱۹۹۰ میلادی (۱۳۶۰ خورشیدی) SYBR GREEN را تولید کرده و وارد بازار کردند. این رنگ یک سیانین نامتقارن است. خانواده سیانین‌ها شامل رنگ‌های آلی مصنوعی متعددی است که در عکاسی، تولید CD و DVD و همچنین پژوهش‌های مولکولی کاربرد دارند.

 پژوهشگران به‌تدریج SYBR GREEN جایگزین رنگ Ethidium Bromide می‌کنند، زیرا میزان جهش‌زایی SYBR GREEN بسیار کمتر است. علاوه بر این، دفع مواد آلوده به SYBR GREEN مشکلات رنگ Ethidium Bromide را ندارد. البته باید توجه داشت پژوهشگران هشدار می‌دهند که هر ماده‌ای که بتواند به DNA متصل شود، ممکن است خاصیت سرطان‌زایی ایجاد کند.

ويژگی ­ها

پایداری و ویژگی‌های اتصال SYBR GREEN 

گروه رنگ­های SYBR GREEN در گستره­ ی دمايي وسيعی پايدار بوده و به همين دليل می­ توان از آن برای نشان دادن واکنش­های بيوشيميايي مختلف در دماهای بالا و پايين استفاده کرد. به­ علاوه، رنگ­های مزبور با سطح مولکول DNA پيوند غيرکووالانسی برقرار می­ نمايند. از اين­رو SYBR GREEN در فعاليت های بسياری از آنزيم­های نوکلئاز و DNA­ پلی­مراز هيچ­ گونه تداخلی را اعمال نمی­ کند.

از ويژگی ­های استثنايي SYBER GREEN توانايي پيوند آن با ميزان بالايي از مولکول­ های DNA می ­باشد. به ­همين دليل است که استفاده از چنين رنگی می ­تواند در تعيين ميزان دقيق DNA در Real-Time PCR کمک زيادی نمايد.

همچنين، از آنجايي ­که رنگ­های SYBR GREEN 25 بار حساس­تر از رنگ Ethidium Bromide می ­باشند، بنابراين اگر ميزان نمونه­ ی مورد بررسی اندک هم باشد پژوهشگر به ­خوبی مشاهده می کند که اين خود يکی از امتيازات ويژه­ ی اين گروه از رنگ­ها می­ باشد .

حساسیت و کاربردهای تحلیلی SYBR GREEN

رنگ SYBR GREEN I، علاوه بر اين­که قابليت پيوند با مولکول­های دو رشته­ ای DNA را داراست می­ تواند به مولکول­های RNA نيز متصل شود، اما ميزان درخشش رنگ، کمتر خواهد بود. این ویژگی، مطالعاتی را که هدفشان مشاهده آپوپتوزیز است، تسهیل می‌کند، زيرا مولکول­های RNA کم­رنگ و مولکول­های دو رشته­ ای DNA که دچار آپوپتوزيز شده­ اند، کاملا پر رنگ خواهند بود.

بررسی‌ها نشان می‌دهد میزان درخشش کمپلکس DNA-SYBR GREEN I پنج برابر بیشتر از کمپلکس DNA-Ethidium Bromide است. برای پر رنگ کردن مولکول‌های RNA باید از رنگ SYBR GREEN II استفاده کرد.

مزايای استفاده از SYBR GREEN:

۱-  رنگ حاصل از درخشش SYBR GREEN سبز بوده که معمولا” برای محصولات بدست آمده از PCR کاربرد فراوان دارد.

دامنه ­ی رنگی SYBR GREEN از زرد به سبز پر رنگ درخشان است که اين ويژگی برای بررسی ميزان محصولات PCR بسيار اهميت دارد.

۲-  رنگ SYBER GREEN زمينه­ ی ژل آگارز و يا پلی­ آکريل آميد را به مانند Ethidium Bromide رنگی نمی­ کند.

از ويژگی­های مهم SYBR GREEN می ­باشد، زيرا اگر اندکی غلظت رنگ زمينه­ ی ژل ( اين مطلب در مورد رنگ Ethidium Bromide صادق است) افزايش يابد، ديگر باندهای ايجاد شده توسط مولکول­های دو رشته ­ای DNA به خوبی قابل مشاهده نيستند.

۳-  از رنگ SYBR GREEN می ­توان برای رنگ­ آميزی مجدد ژل رنگ شده با Ethidium Bromide استفاده نمود.

زيرا باعث رويت بهتر باندها می­ شود و اين مسئله بسيار مطلوب است.

۴-  در هنگام مشاهده ­ی ژل­های رنگ شده با SYBR GREEN به کمک UV transilluminator.

اگر ميزان مولکول­های DNA تک رشته ­ای در ژل زياد باشد، رنگ مربوطه بيشتر به سمت نارنجی درخشان تمايل دارد تا سبز.

۵-  چنانچه، پيوسته از Ethidium Bromide برای رنگ نمودن ژل استفاده شود و ظرف مربوطه به خوبی شسته و يا تميز نگردد، استفاده­ ی دوباره از رنگ SYBR GREEN در همان ظرف، سبب ايجاد باندهای نارنجی درخشان مي­ شود و نه رنگ سبز.

۶-  می ­توان بيش از ۹۹% از رنگ SYBR GREEN I که به مولکول­های دو رشته­ ای DNA متصل شده ­اند را با کمک اتانول جدا نمود.

با توجه به مطالب بيان شده به نظر می­ رسد که در آينده­ ای نه­ چندان دور، رنگ­های خانواده­ ی SYBR GREEN کاملا” جايگزين رنگ Ethidium Bromide می ­گردد. در واقع، هزینه بالای SYBR GREEN تاکنون مانع استفاده گسترده از آن شده است. نويسندگان مقاله­ ی حاضر نيز استفاده از SYBR GREEN را بجای Ethidium Bromide توصيه می ­نمايند.

منابع:

SYBR® Green I Nucleic Acid Gel Stain, Molecular Probes, Inc.http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp07567.pdf, 2006.1)

2)SYBR GREEN I Nucleic Acid Gel Stain, www.roche-applied-science.com/, 2005

3)SYBR Nucleic Acid Gel Stains, http://www.invitrogen.com/, 2003

 Updegraff E., What is SYBR

®?, http://www.wisegeek.com/what-is-sybr-green.htm, 2003-2010.

4)Updegraff E., What is SYBR Gree

5)SYBR Green I, http://en.wikipedia.org/wiki/SYBR_Green_I, 07.22.2010.