پيام بهزادي-عضو هيأت علمی گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس
الهام بهزادي، لرنيک عيساخانيان-گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس
تشخیص عفونتهای قارچی مهاجم ناشی از کپکها
بهطور کلی، قارچهای رشتهای عالی در طبیعت انتشار گستردهای دارند. این قارچها در همه جا یافت میشوند و در ساختار خود دیوارههای عرضی در هیف دارند. قارچهایی مانند Aspergillus.spp میتوانند انسان را آلوده کنند. این آلودگی در بیماران مبتلا به نوتروپنی و نقص سیستم ایمنی شدیدتر است و اغلب به عفونتهای مهاجم منجر میشود. پژوهشگران گزارش کردهاند که میزان مرگومیر ناشی از این عفونتها حدود ۹۲ درصد است.
با این حال، عوامل مختلف روند تشخیص را دشوار میکنند. برای مثال، پزشکان معمولاً نمیتوانند در بیماران مبتلا به ترومبوسیتوپنی روشهای جراحی را انجام دهند. همچنین بسیاری از پزشکان در مراحل اولیه به عفونت قارچی شک نمیکنند. ضعف سیستم ایمنی نیز شرایطی ایجاد میکند که در آن آزمایشهای سرمشناسی اعتبار کافی ندارند. این عوامل تشخیص را پیچیدهتر میسازند.
پزشکان بسیاری از این عفونتها را تنها پس از مرگ بیمار تشخیص میدهند. از سوی دیگر، کارشناسان آزمایشگاه بهندرت موفق میشوند قارچهای رشتهای مانند Aspergillus.spp را از کشت خون جدا کنند. پژوهشگران نیز نشان دادهاند که این قارچها در محیط حضور گستردهای دارند و حتی میتوان آنها را از مجاری تنفسی افراد سالم نیز جدا کرد. بنابراین پزشکان برای تأیید عفونت باید مجموعهای از اطلاعات شامل یافتههای بالینی، تصاویر رادیولوژی و نتایج کشت را همزمان بررسی کنند.
با توجه به این شرایط، روشهایی که بدون جراحی انجام میشوند و در عین حال دقت، حساسیت و اختصاصیت بالایی دارند، بهترین گزینه برای شناسایی عفونتهای قارچی رشتهای مهاجم به شمار میروند. به همین دلیل، پژوهشگران از واکنش زنجیرهای پلیمرراز (PCR) برای بررسی نمونههای بالینی مانند خون استفاده میکنند. این روش حساسیت بالایی دارد و احتمال آلودگی نمونه در آن کم است. علاوه بر این، سهولت انجام کار و تکرارپذیری مناسب، مزیتهای مهم PCR به حساب میآیند.
امروزه آزمایشگاهها برای افزایش دقت و سرعت کار از روش Real-Time PCR استفاده میکنند. پژوهشگران در مطالعات خود نشان دادهاند که Real-Time PCR روشی حساس، اختصاصی و کمی است. این روش برای شناسایی عفونتهای قارچی رشتهای مهاجم در نمونههایی مانند سرم خون بسیار مناسب است. همچنین پیوستگی مراحل Real-Time PCR احتمال آلودگی نمونه را به حداقل میرساند.
همچنين، به دليــل پيوستگی در مراحل Real-Time PCR امکان آلودگی نمونه بسيار کاهش يافته است. آنچه در روشهای مولکولی و از جمله Real-Time PCR از اهميت ويژه ای برخوردار می باشد، آن است که میبايستی از پرايمرهای کارآمد و درست استفاده نمود. معمولاً طراحی پرايمرها و کاوشگرها توسط پژوهشگران و شرکت های سازنده ی کيت های تجاری، آزمون های زيستشناسی مولکولی انجام می گيرد. به دليل اهميت موضوع، در پايين به شرح آن پرداخته می شود.
طراحی پرايمرها و کاوشگرها
بهتر است طراحی پرايمرها بر اساس توالی نوکلئوتيدی يک قارچ مشخص صورت گيرد و پس از ارزيابی و مقايسه چندين ژن، يک توالی مشخص مورد استفاده قرار گيرد. برای مثال، برای شناسايی گونه های قارچ Aspergillus میتــــــــوان با استناد به يکی از گونه های شناخته شده ی آن مانند Aspergillus fumigatus، ژنی مانند ژن RNA ريبوزومی 5.8S که دربردارنده ی توالی های حفظ شده در همه ی گونه های جنس مربوطه است را انتخاب نمود.
برای مطالعه ی نمونههای بالينی، بايستی توجه داشت که توالیهای مربوطه با مولکولهای DNA از مخمر و انسان يکنواختی و همخوانی نداشته باشد. استفاده از پيشنهادات کمپانی ها برای طراحی توالی نوکلئوتيدی پرايمرها و طراحی نظری پرايمرها به کمک نرمافزارهای پرايمرسازی جهت تعيين حساسيت و اختصاصی بودن آنها توسط پژوهشگران و محققين به نتيجه ی بهتر کار بسيار کمک می نمايد. از پرايمرهای مناسب که در مقالات به چاپ رسيده،میتوان به
5′-TTGGTTCCGGCATCGA و 5′-GCAGCAATGACGCTCGG اشاره نمود که توالی ۲۳۵ تا ۳۷۶ از ژن به شماره ثبت AF138288 پايگاه داده های GenBank گرفته شده و دارای ۱۴۲ جفت باز است.
کاوشگر مربوطه 5′-6-FAM-TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA-TAMRA بوده که FAM (6-carboxy-fluorescein) و TAMRA (6-carboxy-N,N,N’,N’-tetramethylrhodamine) هر دو از رنگهای درخشان به شمار می آيند. مجموعه ی توالیهای ياد شده در بالا، به طور قابل توجهی با بسياری از گونه های Fusarium و Scedosporium همخوانی داشته و می توان برای شناسايي آنها استفاده نمود.
طراحی پرايمرها و کاوشگرها نقش مستقيمی در نتيجه ی کار داشته، ضمن اینکه فرآيندسازی مولکولهای DNA مورد مطالعه، به همان ميزان دارای اهميت می باشد.
منابع :
1)Pham, A.S., Tarrand, J.J., May, G.S., Lee, M.S., Kontoyiannis, D.P., Han, X.Y., Diagnosis of Invasive Mold Infection by Real-Time Quantitative PCR, Am J Clin Pathol 2003; 119:38-44
2)Singleton, P., Sainsbury, D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, John Wiley and Sons, 3rd Edition, 2002
