استفاده از Real-Time PCR برای تشخيص عفونت­های ناشی از قارچ‌های رشته ­ای

پيام بهزادي-عضو هيأت علمی گروه ميکروب­ شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس
الهام بهزادي، لرنيک عيساخانيان-گروه ميکروب­ شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس

به­ طور کلی، قارچ­های رشته­ ای عالی که در بردارنده­ ی ديواره ­ی عرضی در هيف­ های خود هستند، در طبيعت انتشار وسيع داشته و در همه جا يافت می ­شوند. برخی از آنها مانند Aspergillus.spp در افراد انسانی و به‌ويژه در بيماران مبتلا به نوتروپنی و نقص در سيستم ايمنی موجب عفونت­های قارچی مهاجم می­ شوند. بررسی‌ها نشان می ­دهند که ميزان مرگ و مير ناشی از عفونت­های قارچی حدود 92% می‌باشد. از اين­رو، تشخيص سريع ‌و قطعی عفونت­های ‌قارچی ‌مهاجم ‌که توسط قارچ‌های رشته­ ای و يا اصطلاحاً کپک­ها ايجاد می­ گردد، نقش تعيين‌کننده­ای را در نجات بيماران از مرگ بر عهده دارد. اما در اين ميان، مشکلاتی وجود دارد که مانع از تشخيص سريع و قطعی عوامل قارچی می­ گردد مانند عدم امکان استفاده از روش­های جراحی در بيمارانی که خونشان به ­صورت طبيعی منعقد نمی­ گردد (ترومبوسيتوپنی)، عدم شک به عفونت­های قارچی، بسياری از بيماری­های قارچی پس از نمونه ­برداری از جسد بيمار شناسايي می ­شوند، بدن بيماران مبتلا به نقص سيستم ايمنی، قادر به واکنش مناسب نبوده، از اين­رو نمی ­توان به کمک آزمون­های سرم‌شناسی اقدام به شناسايي عوامل ميکروبی و از جمله قارچ­ها نمود. بسياری از قارچ­های رشته­ ای و به ­ويژه Aspergillus.spp برخلاف باکتری­ها، به ‌ندرت از کشت خون جدا می­ شوند. به ­دليل انتشار گسترده­ ی قارچ­های رشته­ ای در هوا، در بسياری از موارد حتی از مجاری تنفسی افراد سالم نيز می ­توان آنها را جدا نمود؛ بنابراين، به هنگام جداسازی قارچ­های رشته­ ای از افراد، می­بايستی تظاهرات بالينی، تصاوير راديولوژی و نتايج کشت­های ميکروبی نيز در نظر گرفته شود.

با توجه به آنچه گفته شد، استفاده از روش­هايي که نياز به جراحی نداشته و در عين حال قابل اطمينان، حساس و اختصاصی باشند بهترين گزينه جهت شناسايي عفونت­های قارچی رشته ­ای مهاجم به شمار می ­آيد. به همين دليل استفاده از واکنش زنجيره­ ای پليمراز (PCR) گزينه­ ی مناسبی برای بررسی نمونه ­های بالينی و از جمله خون بوده که دارای حساسيت بالا است و امکان آلودگی نمونه نيز کمتر می ­باشد. ضمن اين­که سهولت و تکرارپذيری آزمايش، جلوه­ای ويژه به روش PCR داده است. امروزه، برای بالا بردن سطح درستی و سهولت آزمايش­ها از Real-Time PCR استفاده می­ گردد. با توجه به مطالعات انجام شده مشخص شده اســـــــت که Real-Time PCR روشی حساس، اختصاصی و کمی است که برای شناسايي عفونت­ های قارچی رشته ­ای مهاجم در نمونه­ های بالينی نظير سرم خون بسيار مناسب است. همچنين، به ­دليــل پيوستگی در مراحل Real-Time PCR امکان آلودگی نمونه بسيار کاهش يافته است، اما آنچه در روش­های مولکولی و از جمله Real-Time PCR از اهميت ويژه­ ای برخوردار می­ باشد، آن است که می­بايستی از پرايمرهای کارآمد و درست استفاده نمود؛ معمولاً طراحی پرايمرها و کاوشگرها توسط پژوهشگران و شرکت­های سازنده­ ی کيت­های تجاری، ‌آزمون­های زيست‌شناسی مولکولی انجام می­ گيرد. به‌ دليل اهميت موضوع، در پايين به شرح آن پرداخته می­ شود.

طراحی پرايمرها و کاوشگرها

بهتر است طراحی پرايمرها بر اساس توالی نوکلئوتيدی يک قارچ مشخص صورت گيرد و پس از ارزيابی و مقايسه‌ چندين ژن، يک توالی مشخص مورد استفاده قرار گيرد. برای مثال، برای شناسايی گونه ­های قارچ Aspergillus می­تــــــــوان با استناد به يکی از گونه­ های شناخته شده­ ی آن مانند Aspergillus fumigatus، ژنی مانند ژن RNA ريبوزومی 5.8S که دربردارنده ­ی توالی­های حفظ شده در همه ­ی گونه­ های جنس مربوطه است را انتخاب نمود. برای مطالعه ­ی نمونه‌های بالينی، بايستی توجه داشت که توالی­های مربوطه با مولکول­های DNA از مخمر و انسان يکنواختی و همخوانی نداشته باشد. استفاده از پيشنهادات کمپانی­ها برای طراحی توالی نوکلئوتيدی پرايمرها و طراحی نظری پرايمرها به کمک نرم‌افزارهای پرايمرسازی جهت تعيين حساسيت و اختصاصی بودن آنها توسط پژوهشگران و محققين به نتيجه­ ی بهتر کار بسيار کمک می ­نمايد. از پرايمرهای مناسب که در مقالات به چاپ رسيده،‌می‌توان به
5′-TTGGTTCCGGCATCGA و 5′-GCAGCAATGACGCTCGG اشاره نمود که توالی 235 تا 376 از ژن به شماره ثبت AF138288 پايگاه داده­ های GenBank گرفته شده و دارای 142 جفت باز است.

کاوشگر مربوطه 5′-6-FAM-TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA-TAMRA بوده که FAM (6-carboxy-fluorescein) و TAMRA (6-carboxy-N,N,N’,N’-tetramethylrhodamine) هر دو از رنگ­های درخشان به ‌شمار می­ آيند. مجموعه­ ی توالی­های ياد شده در بالا، به­ طور قابل توجهی با بسياری از گونه­ های Fusarium و Scedosporium همخوانی داشته و می ­توان برای شناسايي آنها استفاده نمود.

در پايان بايستی توجه داشت که طراحی پرايمرها و کاوشگرها نقش مستقيمی در نتيجه ­ی کار داشته، ضمن اینکه فرآيندسازی مولکول­های DNA مورد مطالعه، به همان ميزان دارای اهميت می ­باشد.

منابع :

1)Pham, A.S., Tarrand, J.J., May, G.S., Lee, M.S., Kontoyiannis, D.P., Han, X.Y., Diagnosis of Invasive Mold Infection by Real-Time Quantitative PCR, Am J Clin Pathol 2003; 119:38-44

2)Singleton, P., Sainsbury, D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, John Wiley and Sons, 3rd Edition, 2002