استفاده از Real-Time PCR برای تشخيص عفونتهای ناشی از قارچهای رشته ای
پيام بهزادي-عضو هيأت علمی گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس
الهام بهزادي، لرنيک عيساخانيان-گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس
به طور کلی، قارچهای رشته ای عالی که در بردارنده ی ديواره ی عرضی در هيف های خود هستند، در طبيعت انتشار وسيع داشته و در همه جا يافت می شوند. برخی از آنها مانند Aspergillus.spp در افراد انسانی و بهويژه در بيماران مبتلا به نوتروپنی و نقص در سيستم ايمنی موجب عفونتهای قارچی مهاجم می شوند. بررسیها نشان می دهند که ميزان مرگ و مير ناشی از عفونتهای قارچی حدود 92% میباشد. از اينرو، تشخيص سريع و قطعی عفونتهای قارچی مهاجم که توسط قارچهای رشته ای و يا اصطلاحاً کپکها ايجاد می گردد، نقش تعيينکنندهای را در نجات بيماران از مرگ بر عهده دارد. اما در اين ميان، مشکلاتی وجود دارد که مانع از تشخيص سريع و قطعی عوامل قارچی می گردد مانند عدم امکان استفاده از روشهای جراحی در بيمارانی که خونشان به صورت طبيعی منعقد نمی گردد (ترومبوسيتوپنی)، عدم شک به عفونتهای قارچی، بسياری از بيماریهای قارچی پس از نمونه برداری از جسد بيمار شناسايي می شوند، بدن بيماران مبتلا به نقص سيستم ايمنی، قادر به واکنش مناسب نبوده، از اينرو نمی توان به کمک آزمونهای سرمشناسی اقدام به شناسايي عوامل ميکروبی و از جمله قارچها نمود. بسياری از قارچهای رشته ای و به ويژه Aspergillus.spp برخلاف باکتریها، به ندرت از کشت خون جدا می شوند. به دليل انتشار گسترده ی قارچهای رشته ای در هوا، در بسياری از موارد حتی از مجاری تنفسی افراد سالم نيز می توان آنها را جدا نمود؛ بنابراين، به هنگام جداسازی قارچهای رشته ای از افراد، میبايستی تظاهرات بالينی، تصاوير راديولوژی و نتايج کشتهای ميکروبی نيز در نظر گرفته شود.
با توجه به آنچه گفته شد، استفاده از روشهايي که نياز به جراحی نداشته و در عين حال قابل اطمينان، حساس و اختصاصی باشند بهترين گزينه جهت شناسايي عفونتهای قارچی رشته ای مهاجم به شمار می آيد. به همين دليل استفاده از واکنش زنجيره ای پليمراز (PCR) گزينه ی مناسبی برای بررسی نمونه های بالينی و از جمله خون بوده که دارای حساسيت بالا است و امکان آلودگی نمونه نيز کمتر می باشد. ضمن اينکه سهولت و تکرارپذيری آزمايش، جلوهای ويژه به روش PCR داده است. امروزه، برای بالا بردن سطح درستی و سهولت آزمايشها از Real-Time PCR استفاده می گردد. با توجه به مطالعات انجام شده مشخص شده اســـــــت که Real-Time PCR روشی حساس، اختصاصی و کمی است که برای شناسايي عفونت های قارچی رشته ای مهاجم در نمونه های بالينی نظير سرم خون بسيار مناسب است. همچنين، به دليــل پيوستگی در مراحل Real-Time PCR امکان آلودگی نمونه بسيار کاهش يافته است، اما آنچه در روشهای مولکولی و از جمله Real-Time PCR از اهميت ويژه ای برخوردار می باشد، آن است که میبايستی از پرايمرهای کارآمد و درست استفاده نمود؛ معمولاً طراحی پرايمرها و کاوشگرها توسط پژوهشگران و شرکتهای سازنده ی کيتهای تجاری، آزمونهای زيستشناسی مولکولی انجام می گيرد. به دليل اهميت موضوع، در پايين به شرح آن پرداخته می شود.
طراحی پرايمرها و کاوشگرها
بهتر است طراحی پرايمرها بر اساس توالی نوکلئوتيدی يک قارچ مشخص صورت گيرد و پس از ارزيابی و مقايسه چندين ژن، يک توالی مشخص مورد استفاده قرار گيرد. برای مثال، برای شناسايی گونه های قارچ Aspergillus میتــــــــوان با استناد به يکی از گونه های شناخته شده ی آن مانند Aspergillus fumigatus، ژنی مانند ژن RNA ريبوزومی 5.8S که دربردارنده ی توالیهای حفظ شده در همه ی گونه های جنس مربوطه است را انتخاب نمود. برای مطالعه ی نمونههای بالينی، بايستی توجه داشت که توالیهای مربوطه با مولکولهای DNA از مخمر و انسان يکنواختی و همخوانی نداشته باشد. استفاده از پيشنهادات کمپانیها برای طراحی توالی نوکلئوتيدی پرايمرها و طراحی نظری پرايمرها به کمک نرمافزارهای پرايمرسازی جهت تعيين حساسيت و اختصاصی بودن آنها توسط پژوهشگران و محققين به نتيجه ی بهتر کار بسيار کمک می نمايد. از پرايمرهای مناسب که در مقالات به چاپ رسيده،میتوان به
5′-TTGGTTCCGGCATCGA و 5′-GCAGCAATGACGCTCGG اشاره نمود که توالی 235 تا 376 از ژن به شماره ثبت AF138288 پايگاه داده های GenBank گرفته شده و دارای 142 جفت باز است.
کاوشگر مربوطه 5′-6-FAM-TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA-TAMRA بوده که FAM (6-carboxy-fluorescein) و TAMRA (6-carboxy-N,N,N’,N’-tetramethylrhodamine) هر دو از رنگهای درخشان به شمار می آيند. مجموعه ی توالیهای ياد شده در بالا، به طور قابل توجهی با بسياری از گونه های Fusarium و Scedosporium همخوانی داشته و می توان برای شناسايي آنها استفاده نمود.
در پايان بايستی توجه داشت که طراحی پرايمرها و کاوشگرها نقش مستقيمی در نتيجه ی کار داشته، ضمن اینکه فرآيندسازی مولکولهای DNA مورد مطالعه، به همان ميزان دارای اهميت می باشد.
منابع :
1)Pham, A.S., Tarrand, J.J., May, G.S., Lee, M.S., Kontoyiannis, D.P., Han, X.Y., Diagnosis of Invasive Mold Infection by Real-Time Quantitative PCR, Am J Clin Pathol 2003; 119:38-44
2)Singleton, P., Sainsbury, D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, John Wiley and Sons, 3rd Edition, 2002