دكتر مهران ايزدي- بورد تخصصي بيماريهاي عفوني
دكتر حسامالدين بحريني- دكتراي علوم آزمايشگاه
اميد معصومي هزاوه- كارشناس ارشد علوم آزمايشگاهي
شناسائي سريع بيماران مبتلا به توبركولوز اهميت ويژهاي دركنترل اين بيماری دارد.
روشهاي مبتني بر NAA) Nucleic Acid Amplification) بويژه PCR به دليل سرعت، حساسيت و ويژگي زياد بطور وسيعي براي شناسايي مايكوباكتريوم توبركولوزيس درنمونههاي باليني استفاده ميشوند، اما محدوديتها و الزاماتي در تشخيص آزمايشگاهي و همچنين درخواست و تفسير آزمايش وجود دارند كه ميتوانند بر صحت نتايج آزمايشگاهي و تشخيص باليني مؤثر باشند.
آزمايشگاه و روشهاي NAA :
هرچند مطالعات متعدد ويژگيهاي عملكردي روشهاي NAA را در تشخيص توبركولوز مشخص كردهاند، اما مطالعاتي كه عملكرد آزمايشگاهي اين روشها را در «شرايط تشخيص روتين» نشان دهند، اندك ميباشند. نتايج مطالعات انجام شده توسط Noordhook و همكاران در سالهاي ۱۹۹۴ و ۱۹۹۶ نگرانكننده بود. آنها نشان دادند كه اختلاف قابل توجهي درتوانائي آزمايشگاهها براي شناسائي مايكوباكتريوم توبركولوزيس در نمونههاي blind وجود دارد.[*]
در اولين مطالعه، هفت آزمايشگاه كه در انجام PCR مايكوباكتريوم تجربه زيادي داشتند شركت كردند، به هر آزمايشگاه ۲۰۰ نمونه مثبت و منفي ارسال شد. ژن هدف IS6110 بود. موارد مثبت كاذب از %۳ تا %۲۲ متغير و دريك آزمايشگاه به %۷۷ رسيد! حساسيت روشها براي نمونههايي كه ۱۰۰۰ باسيل داشتند، بسيار متفاوت و از %۲ تا %۹۰ متغير بود.
در مطالعه دوم ۳۰ آزمايشگاه از ۱۸ كشور شركت داشتند و به هر يك ۲۰ نمونه مثبت و منفي ارسال شد.
محدوديتي از نظر پروتكل تكثير، متد و ماهيت ژن وجود نداشت. در اين مطالعه فقط ۵ آزمايشگاه (%۱۶) نمونههاي مثبت و منفي را بطور صحيح شناسايي كردند و تقريباً نيمي از آزمايشگاهها نتايج مثبت كاذب داشتند. در مورد حساسيت روشها نيز فقط ۷ آزمايشگاه توانستند تمام نمونههاي مثبت را شناسايي كنند.
سومين مطالعه توسط CDC آمريكا در سال ۱۹۹۷ با ارسال نمونه به آزمايشگاههاي داوطلب انجام شد.
نكته قابل تأمل در مطالعات Noordhook باتجربه بودن آزمايشگاههاي شركتكننده در انجام تستهاي NAA و همچنين استفاده از كنترلهاي مثبت و منفي درمراحل تكثير و آشكارسازي دراكثريت موارد بود.
در ذيل مروري بر علل نتايج مثبت و منفي كاذب درتستهاي تكثير اسيد نوكلئيك مايكوباكتريوم توبركولوزيس خواهيم داشت.
علل نتايج مثبت كاذب:
۱- Cross Contamination :
نتايج مثبت كاذب در آزمايشگاههاي كشت و مولكولار مايكوباكتريولوژي يك مشكل شناخته شده است و معمولاً به دليل cross contamination در هنگام آمادهسازي نمونهها اتفاق ميافتد. اين موضوع ناشي از انتقال باسيلها از نمونههاي مثبت و بافرها و ريجنتهاي آلوده و يا وسايل آلوده به نمونههاي منفي در طي فرآيند هضم و آلودگيزدايي نمونه ميباشد.
۲- آلودگي مواد و تجهيزات با Amplicon
۳- باسيلهاي كشته شده:
وجود باسيلهاي كشته شده در طي درمان و يا بعد از اتمام درمان ضد توبركولوزي ميتواند از علل واكنشهاي مثبت كاذب باشد. واكنش مثبت PCR در نمونههاي ريوي حتي ۲/۵ سال پس از اتمام درمان مشاهده شده است.
برونكوسكوپهاي استريل اما آلوده به DNA قابل تكثير مايكوباكتريوم نيز ميتوانند سبب نتايج مثبت كاذب شوند. در يك بررسي، DNA قابل تكثير انسان و مايكوباكتريوم توبركولوزيس به ترتيب از %۲۰ و %۳/۶ برونكوسكوپهاي استريل جدا شده است.
۴- ساير عوامل:
مواردی از قبيل برچسبگذاري اشتباه روي نمونهها، نمونهگذاري نامناسب درحفرات آگار كه سبب پخش DNA در طي الكتروفورز گردد و اشتباه در خواندن نتايج، قابل ذكر هستند.
علل نتايج منفي كاذب:
می توان به وجود مهاركنندهها در نمونههای بالينی، ليز ناكامل نمونه و از دست دادن DNA در فرآيند تخليص اشاره كرد. مواردی چون كيفيت نامناسب و حجم ناكافی نمونه، RCF پايين سانتريفوژ نيز از عوامل مؤثر در نتايج منفی كاذب روشهای كشت و مولكولار می باشند.
راهكارهاي جلوگيري از واكنشهاي مثبت كاذب:
الف- براي جلوگيري از cross contamination رعايت نكات ذيل توصيه ميشود:
آمادهسازی و اقدامات پیش از شروع کار
- هود میکروبیولوژیک حداقل به مدت ۵ دقیقه قبل از شروع به کار روشن شده باشد.
- در فضای داخلی هود، سطوح جانبی و سطح کار با ضدعفونیکننده مناسب ضدعفونی گردند.
- برای عملکرد درست هود، جریان هوا باید حالت پایدار داشته باشد؛ از این رو قبل از کار روی نمونهها، دستها در داخل هود به مدت ۱ دقیقه بیحرکت باشند.
سازماندهی و چیدمان وسایل داخل هود
- از گذاشتن مواد و وسایل غیر ضروری داخل هود خودداری گردد.
- روی قسمتهای مشبک جلویی و عقبی هود وسیلهای قرار ندهید.
- چیدمان طوری باشد که جریان کار از ناحیه تمیز به آلوده باشد تا حرکت اجسام آلوده محدود شود.
- پیپتها، کیسهها و فلاسکهای جمعآوری در یک طرف قرار داده شوند.
- تجهیزات آئروسلزا مانند vortex mixer در قسمت عقب هود و نزدیک به قسمت مشبک قرار داده شوند.
- ظرف جمعآوری وسایل و مواد دورریختنی به صورت افقی قرار داده شود و حاوی ماده ضدعفونیکننده باشد.
اصول کار ایمن در حین آزمایش
- محل انجام کار روی نمونهها حداقل اینچ از قسمت مشبک جلویی فاصله داشته باشد. بازوها را اندکی بالا نگه دارید تا هوای اتاق به داخل قسمت مشبک وارد شود.
- برای کاهش احتمال آلودگی، مواد پاکیزه را حداقل سانتیمتر از فعالیتهای آئروسلزا دور نگه دارید.
- درب لولهها و بطریهای باز را هرچه سریعتر ببندید.
- استفاده از شعله باز و حجیم به دلیل برهم زدن جریان هوای هود مناسب نمیباشد و استفاده از «hooded Bunsen flame» یا «کورههای الکتریکی کوچک لولهایشکل» توصیه میشود.
جلوگیری از آلودگی متقاطع نمونهها
- برای هر نمونه از یک پیپت اختصاصی برای ریختن محلولها استفاده شود.
- برای ریختن محلولهای مشترک مانند بافرها، برای هر نمونه از یک ظرف جداگانه استفاده شود.
- برداشتن و گذاشتن درب لولههای حاوی نمونه بهگونهای باشد که در یک زمان فقط درب یک لوله باز باشد.
- در مرحله هضم و آلودگیزدایی و بعد از سانتریفوژ، به دور ریختن مایع رویی هر نمونه در یک ظرف waste جداگانه انجام شود.
- نمونههایی که احتمال مثبت بودن آنها وجود دارد (اسمیر آنها مثبت است و یا بیمارانی که قبلاً مبتلا به TB بودهاند) به فاصله یک ردیف از سایر نمونهها جدا نگهداری شوند.
اقدامات پایان کار
- سطوح خارجی تمام وسایل و ظروف قبل از خروج از هود ضدعفونی گردند.
- در پایان کار، پارچه و پلاستیک سطح کار جمعآوری و اتوکلاو شوند.
- در پایان کار روزانه، سطوح داخلی هود ضدعفونی گردند.
ب – ممانعت از آلودگی با Amplicon :
رعايت مقررات در آزمايشگاههاي NAA، مانند جدا بودن فضا، تجهيزات، unidirectional work flow، بكارگيري مواد شيميائي غيرفعالكننده amplicon و … لازم است. سيستمهاي بستهاي مانند Real Time PCR دركاهش آلودگي بسيار مؤثر ميباشند.
مطالعه انجام شده توسط CDC در سال ۱۹۹۷ نشان داد كه واكنشهاي مثبت كاذب عمدتاً به آزمايشگاههايی مربوط می شد كه از هود مشترك جهت كشت و اسمير و NAA مايكوباكتريوم استفاده ميكردند. همچنين از unidirectional work flow بی اطلاع بودند يا به آن عمل نمی كردند.
ج- كنترل برونكوسكوپهای استريل:
قبل از برونكوسكوپي لوله برونكوسكوپ با ۵ ميليليتر نرمال سالين استريل شستشو داده شود و مايع حاصله نگهداری شود. درصورت مثبت شدن تست NAA، نرمال سالين مذكور از نظر وجود DNA مايكوباكتريوم توبركولوزيس بررسي شود.
به دليل فقدان يك استاندارد بينالمللي براي تستهاي NAA مايكوباكتريوم توبركولوزيس، كنترل كيفي در تمام مراحل توصيه شده است:
۱- استفاده از كنترلهای مثبت و منفی در هر نوبت كاری و در تمام مراحل لازم است.
۲- بكارگيري Internal Control :
هرچند متدهای گوناگونی برای مونيتورينگ مهاركنندههای Taq پليمراز در نمونههاي باليني توصيف شده است كه می توان به تكثير همزمان DNA غيرتوبركولوزي درخلط تخليص شده يا اضافه كردن DNA كنترل با طراحي ويژه كه قادر است از پرايمرهاي مشابه سكانس هدف استفاده كند اشاره كرد، اما بكارگيري نوعي Internal Control كه امكان مونيتورينگ چهار مرحله آمادهسازی نمونه (هضم و آلودگی زدايی)، تخليص، تكثير DNA و آشكارسازي محصول را فراهم كند، ارجحيت دارد و می توان:
الف- هر نمونه بصورت دوبل آزمايش شود.
به يكي از نمونهها تعداد اندكي باسيل M. bovis BCG اضافه شود (spiked sample). اما تمايل مايكوباكتريومها به تشكيل كلامپ تهيه سوسپانسيون مناسب را مشكل ميكند، به همين دليل ريجنتهاي كنترل بايد تحت شرايط استاندارد تهيه شوند و بصورت تجارتي در دسترس قرار گيرند.
ب– استفاده از تارگت مديفيه شده:
Kolk و همكاران درگزارشي جالب، از يك سوية تغيير يافته M. smegmatis استفاده كردند. در اين سويه، ماركر ژنتيكي IS6110 اندكي از IS6110 تيپ وحشي بزرگتر بود. با اضافه كردن تعداد اندكي از چنين سويهاي به هر نمونه باليني، يك كنترل داخلي تقريباً كامل بدست ميآيد.
۳- استفاده از دو سيستم تكثير با پرايمرهاي اختصاصي برای سكانسهای هدف متفاوت در ژنوم M. tuberculosis نتايج قابل اعتمادتري دارد.
۴- آزمايش مجدد نمونههايي كه مثبت شدهاند، موارد مثبت كاذب را كمتر ميكند.
تشخيص بالينی و روشهای NAA :
اكثر مطالعات نتايج روشهاي NAA را بر مبناي ملاكهاي آزمايشگاهي ارزيابي كردهاند، اما تعاريف باليني و آزمايشگاهي از بيماري ممكن است تفاوت داشته باشند. تشخيص آزمايشگاهي در سطح آناليز نمونه انجام ميشود، اما تشخيص باليني بر موارد متعددي همانند علائم و نشانه باليني، نتايج آزمايشگاهي و پاسخ به درمان استوار است.
در موارد تشخيصي پيچيدهاي همچون توبركولوز، تعيين clinical risk ميتواند در مورد ارزش پيشبيني (predictive value) يك تست اطلاعات مهمي بدست دهد، به عبارت ديگر «شك باليني به (CSTB) TB» كه متكي بر قضاوت پزشك است و به سه سطح: شك كم، متوسط و زياد تقسيم ميشود ميتواند راهنماي استفاده از تستهاي NAA درگروه بيماران با سطوح متفاوت CSTB باشد.
ارزش پيشبيني مثبت (PPV) يك تست، پيشبيني درستي نتيجه مثبت تست درفرد بيمار ميباشد. بالا بودن حساسيت و ويژگي لزوماً بيانگر بالا بودن PPV نميباشند، زيرا ميزان شيوع و پراكندگي بيماري فاكتور مهمي در تعيين ميزان صحت PPV ميباشد. روابط فوقالذكر در فرمول زير نمايش داده شده است.
درصد پيشبيني مثبت :
به عنوان مثال اگر حساسيت و ويژگي آزمايش هر يك %۹۵ باشد، در دو پراكندگي متفاوت 50% و 5% بيماري، ميزان پيشبيني مثبت بترتيب 95% و ۵۰% خواهد بود يعني در حالت اخير فقط در 50% موارد نتيجه مثبت آزمايش واقعا” مثبت ميباشد.
هر چند تستهای NAA براي تشخيص اوليه در بيماران مشكوك به توبركولوز توصيه ميشود، اما درحال حاضر اين تستها نبايد بطور روتين براي بيماران «low CSTB» درخواست شوند زيرا PPV در چنين مواردي نزديك به ۵۰% است. دربيماران فوقالذكر تستهاي AFB Smear و NAA براي كنار گذاشتن بيماري مناسب، اما براي اثبات آن متقاعدكننده نيستند، زيرا در اين گروه بيماران نتايج مثبت كاذب ممكن است نزديك به موارد مثبت واقعي برسند، تستهاي مذكور براي اثبات بيماري درگروه «high CSTB» مفيد ميباشند.
در بيماراني كه اسمير خلط آنها منفي است، PPV مربوط به تستهاي NAA، حتي با استفاده از كيتهاي مورد تأييد FDA، پايين ميباشد و توصيه ميشود در اين گروه از بيماران تستهاي NAA زماني درخواست شود كه تظاهرات باليني قوياً به نفع TB باشد.
توجه به نكات ذيل درانتخاب تستها و تصميمگيري مناسب، مفيد ميباشد:
۱- درتشخيص آزمايشگاهي توبركولوز هيچ تستي به تنهايي كامل نيست.
۲- تستهاي NAA نقش مكمل دارند، اما جانشين AFB Smear كشت و قضاوت باليني نيستند و براي هر نمونهاي روشهاي روتين (كشت و اسمير) نيز بايد بطور موازي انجام شود.
۳- حساسيت روشهاي NAA از كشت كمتر و از AFB Smear بالاتر است.
۴- كشت همچنان براي تأييد آزمايشگاهي توبركولوز استاندارد طلايي ميباشد.
۵- انجام آزماش باكتريولوژيك نبايد تا زمان حصول نتايج تست NAA به تأخير بيفتد.
۶- تستهاي NAA كه درحال حاضر دردسترس ميباشند نبايد بطور روتين براي بيماران «low CSTB» درخواست شوند.
۷- نتيجة منفي NAA نبايد به عنوان ملاك قطعي رد توبركولوز تلقي شود، بخصوص در بيماراني كه CSTB متوسط و بالا باشد، اما ميتواند به عنوان اطلاعات زمينهاي براي تصميمگيري باليني، تشخيص افتراقي و يا جلوگيري از درمان غيرضروري منظور گردد.
الگوريتم آزمايش و تفسير تستهاي NAA :
CDC الگوريتم تشخيصی ذيل را توصيه نموده است:
۱- نمونههاي تنفسي بطور روتين براي انجام تستهاي اسمير و كشت جمعآوري شوند. حداقل بر روي يك نمونه آزمايش NAA انجام شود.
۲- نتايج تستهاي NAA درارتباط با نتايج AFB Smear تفسير شوند.
الف- قضاوت باليني ملاك شروع درمان باشد، درانتظار نتيجة كشت و تستهاي تشخيصي باشيد.
ب- حضور مهاركننده درنمونه بررسي شود و نمونه ديگري با روش NAA تست شود.
مهاركننده حضور دارد: براي اين نمونه روش NAA كمك كننده نيست، قضاوت باليني ملاك شروع درمان باشد. درانتظار نتيجة كشت و تستهاي تشخيصي ديگر باشيد.
مهاركننده حضور ندارد: قضاوت باليني ملاك شروع درمان باشد. درانتظار نتيجه كشت باشيد اگر نمونه دوم نيز مجدداً همين شرايط را داشته باشد وجود مايكوباكتريوم غيرتوبركولوزي (MOTT) محتمل است.
ج- قضاوت باليني ملاك شروع درمان باشد. در انتظار نتيجه كشت باشيد. براي تاييد نتيجه NAA، نمونه ديگری آزمايش شود. اگر نتيجه NAA دو يا چند نمونه مثبت بود تا زمان مشخص شدن نتيجه كشت، وجود توبركولوز محتمل است.
د- وجود توبركولوز محتمل است، درمان شروع شود. منتظر جواب كشت نيز باشيد.
