مايكوپلاسماها (Mycoplasmas)

دكتر رضا ميرنژاد- باكتريولوژيست، استاديار دانشگاه

 

مایکوپلاسماتاسه کوچکترین باکتری (0/1تا 0/3 ميكرومتر قطر دارند) با قدرت رشد بسیار آرام و سخت بر روی محیط‌های کشت مصنوعی می‌باشند. گونه‌های مختلفی از مایکوپلاسماها در ناحیه دستگاه تنفسی و ادراری- تناسلی زنان و مردان وجود دارند که به صورت ارگانیسم‌های فرصت طلب عمل می‌کنند و سبب بیماری‌های مختلف در ناحیه دستگاه تنفسی، ادراری- تناسلی، اختلال در تولیدمثل و مرگ و میر نوزادان می‌شوند. مهم‌ترین این گونه‌ها که سبب بیماری‌های متنوعی در مردان، زنان و نوزادان می‌شوند عبارتند از: مایکوپلاسما پنومونیه، مایکوپلاسما هومینیس، اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم و مایکوپلاسما ژنیتالیوم. مايكوپلاسما پنومونيه عامل پنوموني آتيپیك اوليه و تراكئوبرونشيت، تنها مايكوپلاسمای پاتوژن انساني است. اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم که دارای دو بیوار اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم و اوره‌آپلاسما پاروم می‌باشد، عامل اصلی اورتریت غیرگنوککی و غیرکلامیدیائی، پروستاتیت حاد، کوریوآمنیوناتیس، سرویسیت، واژینیت، سپسیس و زایمان زودرس است. مایکوپلاسما هومینیس اغلب در ارتباط با سرویسیت، واژینیت، پیلونفریت، PID، سپتی‌سمی بعد از زایمان، زایمان زودرس و تولد نوزاد نارس می‌باشد. مایکوپلاسما ژنیتالیوم اغلب سبب اورتریت، سرویسیت، واژینیت و اندومتریت حاد می‌شود. وقتی نوزاد از کانال زایمان متولد می‌شود، این باکتری‌ها وارد دستگاه تنفسی او شده و باعث پنومونی، مننژیت و مرگ در آنها می‌گردند. همچنین این باکتری‌ها می‌توانند در طول حاملگی با عبور از جفت در جنین سپسیس ایجاد کرده و بدنبال آن عفونت داخل رحمی بدهند.

 تشخیص عفونت‌های مایکوپلاسماها

شناسائی و تشخیص آزمایشگاهی عفونت‌های مایکوپلاسماها براساس تست‌های باکتریولوژیک شامل مورفولوژی، خصوصیات کشت، خواص فیزیولوژی و سرولوژی می‌باشد. با وجود اين‌كه این تست‌ها هنوز بخش مهمی از تشخیص مایکوپلاسماها را تشکیل می‌دهند، ولی تست‌های جدید براساس آنالیز مولکولی DNA ژنومی، RNAهای ریبوزومی، پروتئین‌های سلولی و لیپیدها تست‌های کلاسیک را در تنگنا قرار داده و به‌ دلیل رشد آرام و سخت‌گیر بودن گونه‌ها، استفاده از تست‌های مولکولی که به زمان كمتري جهت تشخيص نياز دارند، محبوب‌تر مي شود.

 انواع نمونه‌ها

          با توجه به روش‌های تشخیصی، بایستی سلول‌های جمع‌آوری شده که حاوی مایکوپلاسماهای چسبیده می‌باشند، تهیه گردند. بیشتر نمونه‌هائی که برای کشت مناسب هستند، برای PCR هم مناسبند. انواع روش‌های متفاوت نمونه‌گیری برای دستگاه تنفسی ارائه شده است. خلط چون دارای آلودگی می‌باشد، زیاد مناسب نیست. سوآب گلو و آسپیره نازوفارنژیال برای کودکان بسیار مناسب است. مي‌توان براي شناسائي مايكوپلاسما پنومونيه از نمونه‌هاي شستشوي گلو، خلط، آسپيره ناي و تكه‌هاي بافت ريه نیز استفاده كرد.

برای مایکوپلاسماهای ژنیتال سوآب‌های مجاری ادراری، ادرار اولیه (FVU)، منی، ترشحات پروستات، سوآب واژن – سرویکس، بیوپسی اندومتریک، برس زدن توبول، مایع آمنیوتیک، جفت، نمونه‌های اندوتراكئال و CSF از نوزادان نمونه‌های مناسبی هستند.

مایکوپلاسماها از نمونه‌های دیگر مانند CSF، مایع مفصلی، بیوپسی، نمونه‌های جلدی مخاطی و خون جدا می‌شوند. باید توجه داشت که محیط‌های کشت خون حاوی آنتی‌کواگوالانت هستند که برای رشد مایکوپلاسماها بازدارنده می‌باشند.

سوآب باید از جنس داکرون، کلسیم آلژینات یا پلی‌استر با دسته پلاستیکی یا آلومینیمی باشد. سوآب پنبه‌ای و سوآب‌های با دسته چوبی بدلیل اینکه برای اورپلاسماها سمی می‌باشند، مورد استفاده قرار نمی‌گیرند. هرچند که در کشور ما بدلیل گرانی سوآب‌های پلی‌استری از سوآب‌های پنبه‌ای و سوآب‌هائی با دسته چوبی استفاده می‌شود. اگر پاتوژن‌های دستگاه ژنیتال دیگر بطور همزمان مدنظر باشند سوآب داکرون یا رایون با دسته پلاستیکی بسیار مناسب می‌باشد، چرا که آنها برای این گونه پاتوژن‌ها غیرسمی هستند. بعد از گرفتن نمونه نباید اجازه دهیم سوآب خشک شود و سریعاً باید در محیط کشت انتقال یا محیط کشت مناسب قرار بگیرند.

دیگر مایعات بدن و بیوپسی بافت باید در ظروف استریل جمع‌آوری شوند. نمک برای نمونه‌های بافتی مرطوب بکار نمی‌رود، چرا که سبب لیز ارگانیزم‌ها می‌شود.

در آزمایشگاه نمونه‌های بافتی می‌بایستی در محیط‌های انتقال استریل جهت تهیه سوسپانسیون 10% (W/v) و رقت‌های یک‌دهم و یک‌صدم قطعه‌قطعه شوند. این کار ضروری است، چرا که سبب از بین رفتن اثر بازدارندگی هموگلوبین، فسفولیپیدهای سمی، آنتی‌بادی یا کمپلمان که در نمونه‌های بافتی وجود دارند، می‌شود. این رقت‌ها سپس باید به محیط رشد تلقیح شوند. نمونه‌های خون برای مایکوپلاسما با تلقیح محیط رشد در میزان یک  بخش خون به 9 بخش محیط مایع (رقت یک‌دهم) کشت داده می‌شوند. اپتیمال حداقل ml 10خون از فرد بالغ بایستی کشت داده شود. بطور ایده‌آل محیط رشد نبایستی حاوی سدیم پلی آنتون سولفونات (SPS) که بازدارنده رشد گونه‌های مایکوپلاسما است، باشد. همانند کشت نایسریا گونوره‌آ می‌توان اثرات بازدارندگی SPS را با اضافه کردن ژلاتین استریل در حجم نهائی 1% از بین برد. بایستی محیط براث تلقیح شده بصورت کور ساب‌کالچر شود.

محیط‌های انتقال

 مایکوپلاسماها باکتری‌های بسیار حساس به شرایط محیط جانبی هستند، به طوری‌که نمونه‌ها می‌بایستی بعد از جمع‌آوری، سریعا” به محیط انتقال یا کشت مناسب انتقال داده شوند. انواع مختلفی از محیط‌های انتقال برای کشت مایکوپلاسماهای ژنیتال بکار می‌روند. این محیط‌ها شامل تریپتیکاز سوی براث با 0/5 درصد آلبومین سرم گاوی، 2SP براث (10% سرم جنین گاوی غیرفعال شده با سوکروز M0/2 در فسفات بافر M0/02 با 7/2=pH)، یا انواع مختلفی از محیط‌های رشد مایکوپلاسماها (مانند SP-4، B10 براث شپرد و PPLO براث) می‌باشند. آنتی‌بیوتیک‌ها و عوامل ضد قارچی و پنی‌سیلین (100/000 – 50/000 واحد در میلی‌لیتر)، پلی‌میکسینB (5000 میکرولیتر در میلی‌لیتر) و آمفوتریسینB (2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) (در غلظت نهائی محیط کشت) عموماً جهت کاهش آلودگی توسط سایر باکتری‌ها و قارچ‌ها به محیط کشت و انتقال اضافه می‌شوند. نمونه‌ها سریعا” بایستی به آزمایشگاه ارسال شوند، ولی می‌توان نمونه‌ها را در یخچال در 4 درجه سلسیوس به مدت 48-24 ساعت نگهداری کرد. اگر کشت بیشتر از این زمان به تأخیر انجامد، بایستی نمونه‌ها را در منفی 7 درجه سلسیوس فریز کرد. بایستی قبل از کشت، این نمونه‌هاي فریز شده در بن‌ماری 37 درجه سلسیوس حرارت ببیند.

نمونه‌های ادرار برای کشت بایستی سانتریفوژ و رسوب آن 1:1 قبل از فریز با محیط انتقال رقیق شوند. بدلیل اینکه در محیط انتقال پروتئین‌ها پایدار باقی می‌مانند، لذا تعداد ارگانیسم‌هاي زنده در فریز کاهش نمی‌یابد.

روش‌های تشخیصی

 تشخیص آزمایشگاهی مایکوپلاسماها با بکارگیری جداسازی مستقیم بوسیله کشت، روش‌های مولکولی، تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی و سرولوژی انجام می‌شود. تقریبا” همه این روش‌ها برای مایکوپلاسما پنومونیه و مایکوپلاسماهای ژنیتال در دسترس می‌باشند.

کلنی های مایکوپلاسما

کشت

   کشت مایکوپلاسماها برای گونه‌های خاص مانند مایکوپلاسما هومینیس و اورپلاسماها و مایکوپلاسما پنومونیه می‌باشد، ولی برای مایکوپلاسماهای سخت‌گیر مانند مایکوپلاسما ژنیتالیوم و مایکوپلاسما فرمنتانس و پنترانس با موفقیت کمی همراه می‌باشد.

انواع محیط کشت

  به دلیل محدودیت مقدار اطلاعات ژنتیکی که بوسیله این ارگانیسم‌ها حمل می‌شود، قدرت بیوسنتز محدودی دارند. کشت آنها در خارج از بدن احتیاج به محیط‌های پیچیده برای تهیه مواد مورد نیاز آنها دارد. به همین جهت محیط‌های کشتی که برای کشت مایکوپلاسماها مورد استفاده قرار می‌گیرند، پیچیده بوده و با اضافه کردن آنتی‌بیوتیک‌های ß لاکتام (پنی‌سیلین یا آمپلی‌سیلین)، پلی میکسین A و آمفوتریسین B انتخابی می‌شوند. از محیط‌های مختلفی مانند PPLO آگار و براث، SP-4 براث و آگار، U-9 اوره‌آز،2-S بوستون براث، A7 شپرد (محیط آگاردار و یک نوع محیط افتراقی)، A7B، A8 و محیط دی‌ ‌فازیک گلوگز- متیلن بلو برای کشت مایکوپلاسماها استفاده می‌شود. بعضی از مایکوپلاسماها همانند ویروس‌ها می‌توانند در کشت سلولی اثر سایتوپاتیک (CPE) ایجاد نمایند، مانند مایکوپلاسما پنترانس که در in vitro ایجاد CPE می‌کند، لذا از رده‌های سلولی مختلف می‌توان برای کشت این مایکوپلاسماها استفاده کرد.

محیط SP-4 و یا محیط Edward غنی شده با 5-3 درصد سرم اسب برای جداسازی مایکوپلاسما پنومونیه و مایکوپلاسما ژنیتالیوم که دیر رشد هستند، توصیه می‌شود.

به دلیل اینکه مایکوپلاسما هومینیس و اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم سوبسترای مختلفی را در pH های متفاوت متابولیزمی‌کنند، بیشتر آزمایشگاه‌ها دو نوع محیط آگار را با سوبسترای مختلف(گلوکز و آرژینین) برای کشت آن‌ها استفاده می‌کنند. به‌علاوه از محیط دی فازیک براث و آگار می‌توان استفاده کرد.

محیط H براث و H آگار برای ایزوله کردن مایکوپلاسما هومینیس در pH خنثی(حدود 7) مورد استفاده قرار می‌گیرد. بعضی از محیط‌ها ممکن است حاوی آرژینین به عنوان سوبستراي رشد باشند که پس از رشد باکتری در این محیط کدورت و تغییر رنگ فنل رد به سمت قلیائی مشاهده می‌گردد.

 محیط U براث و U آگار برای ایزوله کردن اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم بکار می‌رود که pH پائین (6/5-5/5) دارد و از اوره به عنوان سوبستراي رشد در آن استفاده شده است. می‌توان با اضافه کردن لینکومایسین به محیط‌ها، آنها را برای اورپلاسما اوره آلیتیکوم انتخابی کرد، چرا که اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم به این آنتی‌بیوتیک مقاوم می‌باشد، ولی مایکوپلاسما هومینیس به آن حساس است.

محیط‌های PPLO براث و آگار حاوی محیط پایه (محیط پایه Heart infusion peptone broth )، عصاره مخمر (10%)، سرم اسب (20%)، فنل رد (0/4%) بعنوان معرف تغییر pH محیط و محلول متیلن بلو (1%)، محلول تالیوم استات (10%)، محلول اوره یا آرژینین یا گلوکز (10%)، محلول پنی‌سیلین (100-50 هزار واحد در میلی‌لیتر حجم نهائی محیط کشت) می‌باشد که برای جداسازی مایکوپلاسماها مورد استفاده قرار می‌گیرند. این محیط‌ها را می‌توان با تغییراتی به عنوان U براث یا آگار یا H براث یا آگار برای جداسازی مایکوپلاسماهای ژنیتال استفاده کرد. مثلاً در U براث و H براث هم سرم اسب و هم اوره یا آرژینین بجای گلوکز استفاده می‌شود. لازم بذکر است که معمولاً پنی‌سیلین و استات تالیوم را برای جلوگیری از رشد باکتری‌های دیگر به محیط اضافه می‌کنند، اما بدلیل حساسیت اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم و مایکوپلاسما ژنیتالیوم و به میزان کمتری مایکوپلاسما هومینیس به استات تالیوم، باید از افزودن این ترکیب به محیط کشت ارگانیسم‌های نام برده خودداری نمود. این محیط‌ها که توسط کارخانه بصورت پودر آماده می‌شود، بصورت تجاری در دسترس می‌باشد.

بسیاری از نژادهای مایکوپلاسما روی آبگوشت Heart infusion peptone با 20% آگار ( با pH=7.8) که به آن حدود 30% مایع آسیت انسانی یا سرم حیوانی (اسب یا خرگوش) اضافه شده است، رشد می‌کنند. بعد از 48 تا 96 ساعت نگهداری محیط کشت در دمای 37 درجه سلسیوس ممکن است کدورتی وجود نداشته باشد، اما رنگ‌آمیزی گیمسای رسوبات سانتریفوژ شده، ساختمان‌های مشخصی با اشکال متنوع را نشان می‌دهد و کشت‌های بعدی آن، در محیط‌های جامد منجر به تشکیل کلنی‌های کوچک به نام اسفرول (Spherolos) می‌گردد.

سرم اسب ترکیب ضروری محیط‌های مایکوپلاسما است که اسیدهای چرب و کلسترول را تأمین می‌کند. منبع تهیه سرم، حیواناتی مانند اسب، خرگوش و گاو می‌باشند. عصاره مخمر که منبع تأمین پیش‌سازهای اسیدهای نوکلئیک است همراه با دیگر ترکیبات مانند کوآنزیم‌ها و عصاره بافتی (برحسب گونه مورد بررسی مایکوپلاسما) به محیط‌های کشت افزوده می‌شود.

بدلیل اینکه بعضی گونه‌ها سخت‌گیر می‌باشند، بهتر است نمونه‌ها هم در محیط مایع و هم در محیط جامد کشت داده شوند (کشت اولیه و بعد روی آگار ساب‌کالچر شوند). محیط‌های مایع می‌بایستی در رقت یک‌دهم تا یک هزارم رقیق شده تا بازدارنده‌ها از بین بروند. همچنین در ارزیابی کمی باید این رقت‌ها تهیه گردند. در خصوص مایکوپلاسماهای سخت‌گیر، داشتن کنترل کیفی از محیط کشت ضروری می‌باشد.

بطورکلی در محیط کشت مایع شرایط اتمسفر معمولی برای رشد آنها مطلوب است، ولی در محیط‌های کشت جامد، در بسیاری از موارد حضور 5% گاز کربنیک ضروری است. برخی از گونه‌های مایکوپلاسما، هوازی یا بی‌هوازی اختیاری هستند و بعضی از انواع نیز دارای رشد بهتری در محیط‌های حاوی هیدروژن یا نیتروژن 95% همراه با 10-5% گاز کربنیک می باشند.

از فاکتورهای مؤثر در رشد مایکوپلاسماها، pH محیط کشت می‌باشد که برای آن دسته که گلوکز، آرژینین یا اوره مصرف می‌کنند به‌ترتیب شامل 7/8-7/3، 8-7 و 6/5-6 می‌باشد.

محدوده درجه حرارت برای رشد مایکوپلاسماها   از گونه‌ای به گونه دیگر متفاوت و از 40-20 درجه سلسیوس  است. درجه حرارت اپتیمم برای بیشتر مایکوپلاسماهای انسانی و حیوانات خونگرم حدود 37-36 درجه سلسیوس می‌باشد.

 جداسازی و شناسائی مایکوپلاسماها

در محیط مایع حاوی گلوکز، رشد گونه‌های تخمیری به‌خصوص مایکوپلاسما پنومونیه به‌راحتی از روی مشاهده تغییر رنگ اندیکاتور pH (اسیدی شدن محیط) مشخص می‌شود و این مایکوپلاسماي مهم انسانی براساس خواص بیوشیمیائی خاص (تخمیر گلوکز و فقدان هیدرولیز آرژینین)، همادسوپوریشن یا هماگلوتیناسیون اریتروسیت‌های مرغ با خوکچه هندی (در نبود مایکوپلاسماهای کومنسال منفی) و همولیز سرد شناسائی می‌شود. در گذشته با اینکه سرم ایمن تجارتی وجود نداشت، شناسائی آنتی‌ژن مایکوپلاسما پنومونیه (قبلاً به‌عنوان روش رفرانس شناخته می‌شد) انجام می‌شد. با این روش خیلی مشکل است که این مایکوپلاسما را از مایکوپلاسما ژنیتالیوم که از نظر آنتی‌ژنی به‌هم نزدیک می‌باشند و خواص بیوشیمیایی مشابه دارند، جدا کرد. امروزه از روش‌های مولکولی مانند PCR جهت افتراق این دو استفاده می‌گردد.

بطوركلي مایکوپلاسما پنومونیه توانايي تبديل گلوكز به اسيد، رشد آهسته (8 تا 15 روز) بر روي محيط‌هاي دي ‌فازيك، توليد هموليز بتا بر روي محيط مناسب و قدرت احياء تري‌فنيل تترازوليوم به مادة قرمزي به نام فورمازان كه از مشخصات مايكوپلاسما پنومونيه است را دارد. بر روي آگار خوندار خوكچه هندي، مايكوپلاسما پنومونيه مي‌تواند اريتروسيت‌ها را جذب كند. در ضمن مي‌توان كلني‌هاي مشكوك به مايكوپلاسما پنومونيه را با آنتي‌بادي فلورسين نشاندار مجاور كرده، سپس آن را با ميكروسكوپ اپي‌فلورسنت مورد بررسي قرار داد.

مایکوپلاسماهایی که از نمونه‌های دستگاه ژنیتال جداسازی می‌شوند، عبارت از: مایکوپلاسما هومینیس، مایکوپلاسما ژنیتالیوم، مایکوپلاسما فرمنتانس و اوره‌آپلاسما اوره‌آ‌لیتیکوم و غیره می‌باشند. درحالیکه مایکوپلاسما هومینیس و اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم به آسانی کشت داده می‌شوند، مایکوپلاسما ژنیتالیوم و فرمنتانس رشد آرامی دارند و به سختی از طریق کشت جداسازی می‌شوند، بنابراین روش‌هاي کشتی که امروز استفاده می‌شوند برای جداسازی آن‌ها از دستگاه ژنیتال مفید نمی‌باشند. برای مثال محیط SP-4 که حاوی گلوکز است، مناسب برای جداسازی مایکوپلاسما ژنیتالیوم می‌باشد. اگرچه خیلی از آزمایشگاه‌ها تاکنون نتوانسته‌اند از محیط‌های حاوی گلوکز برای جداسازی مایکوپلاسماهای ژنیتال استفاده نمایند. مایکوپلاسما فرمنتانس هم از گلوکز استفاده می‌کند، ولی رشد آرامی دارد، لذا بطورکلی با توجه به کشت، بسیاری از مایکوپلاسماهای ژنیتال به جز مایکوپلاسما هومینیس و اوره‌آ پلاسما اوره‌آلیتیکوم تشخیص داده نمی‌شوند. لازم بذكر است كه مایکوپلاسما ژنیتالیوم به‌سختی توسط روش‌های کشت جداسازی می‌شود.

کلنی های مایکوپلاسما روی محیط SP4

برای کشت مایکوپلاسما هومینیس و اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم نمونه‌های مناسب که از طریق محیط انتقال دریافت می‌شود، به محیط مایع و جامد تلقیح می‌شود. عموما” ml 0/2 از نمونه بایستی به محیط آگار یا محیط براث تلقیح شوند. محیط‌های براث می‌توانند در شرایط هوازی در 35 درجه سلسیوس انکوبه شوند، ولی محیط‌های جامد باید در شرایط بی‌هوازی در کندل جار در مجاورت CO2 انکوبه شوند. در محیط مایع تغییر رنگ به طرف قلیائی و کدورت (در مورد مایکوپلاسما هومینیس) مثبت در نظر گرفته می‌شود و بایستی روی محیط جامد ساب‌کالچر شوند. در اینجا باید توجه شود که بازدید روزانه محیط مایع ضروری می‌باشد، چرا که اگر تغییر رنگی مشاهده شود و پاساژ روی محیط جامد انجام نگردد، چون pH بالا برای باکتری مضر می‌باشد سبب کاهش تعداد باکتری‌های زنده می شود، لذا ممکن است در محیط جامد کلنی تشکیل نشود. مشاهده تغییر رنگ برای گونه‌های اوره‌آ پلاسماها 24-18 ساعت و برای مایکوپلاسما هومینیس 48 ساعت و 20-6 روز برای مایکوپلاسما پنومونیه و برای مایکوپلاسماهای سخت‌گیر بیشتر طول می‌کشد.

در سطح محیط‌های جامد، مایکوپلاسماها به‌تدریج یک کلنی گنبدی شکل را در سطح آگار بوجود می‌آورند. بخش مرکزی کلنی به درون آگار به سمت پایین رشد کرده و یک هسته مرکزی متراکم‌تر را بوجود می‌آورد. اگر کلنی را از بالا مشاهده کنیم شبیه به ظاهر تخم‌مرغ نیمرو (Fried egg) بنظر می‌رسد برای مشاهده آنها اغلب به میکروسکوپ نیاز خواهد بود. این فرم از کلنی مشخصه مایکوپلاسماهای کلاسیک است که به نام مایکوپلاسماهای Large colony forming معرفی می‌گردند. اوره‌آپلاسماها قادر به تشکیل چنین کلنی‌هایی نیستند، ولی با افزودن برخی از مواد بافری می‌توان امکان تشکیل چنین کلنی‌هایی را فراهم کرد. اندازه کلنی برای مایکوپلاسماهای کلاسیک 600-200 میکرون و برای اوره‌آپلاسما که قبلاً به نام مایکوپلاسماهای T-strain یا   T-mycoplasma (T اول کلمه Tiny به معنی ریز و کوچک است) شناخته می‌شد، حدود 30-15 میکرون است. کلنی‌های اخیر فاقد حاشیه رشد سطحی بوده و در نتیجه ظاهر تخم‌مرغ نیمرو شده ندارند. بطورکلی، اگر کلنی با ظاهری تخم‌مرغ نیمرو (Fried egg) روی محیط جامد مشاهده شد مایکوپلاسما هومینیس تأئید می‌گردد، ولی اگر کلنی‌های کوچک، متراکم مشاهده گردید، اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم تأئید می‌شود.

پیشنهاد می‌گردد جهت تفکیک کلنی‌های تیپیک مایکوپلاسماها از کلنی‌های L- form باکتری‌ها، هر ایزوله جدیدی که در آزمایشگاه جدا می‌شود و بنظر می‌رسد مایکوپلاسما است را حداقل 5 مرتبه بر روی محیطی که فاقد پنی‌سیلین یا آنتی‌بیوتیک مؤثر بر دیواره سلولی هستند کشت مجدد دهند؛ زیرا واریانت‌های L- form پس از حذف آنتی‌بیوتیک، مجددا” به شکل والدین خود برگشته و شکل تخم‌مرغ نیمرویی را از دست می‌دهند.

اگر بخواهند باکتری‌ها را از محیط جامد، به محیط‌های تازه‌ای منتقل کنند، باید یک ورقه نازک چهارگوش از آگار را که در آن یک یا چند پرگنه وجود داشته باشد بردارند و بر روی محیط جامد بمالند یا در محیط مایع بیندازند. هرگاه بخواهند آنها را رنگ‌آمیزی نمایند، ورقه مزبور را برروی یک لام گذاشته و پس از قرار دادن یک لامل بر روی آن مقداری محلول گیمسا در میان لام و لامل بریزند و صبر کنند تا خشک شود.

اگر رشدی در طی 7-5 روز در محیط مایع ساب‌کالچر شده یا جامد مشاهده نگردید، کشت از نظر مایکوپلاسماهای ژنیتال منفی گزارش می‌شود. بهتر است یک حجم از محیط مایع اولیه مثبت شده در فریز منفی 70 تا تعیین نتیجه کشت روی محیط جامد یا ساب‌کالچر مایع نگهداری شود. در ادامه پروتکل جداسازی مایکوپلاسما هومینیس و اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم از نمونه‌های ژنیتال ارائه شده است.

شناسائی مایکوپلاسما هومینیس به‌آسانی صورت می‌گیرد، چرا که با دیدن کلنی با نمای تخم‌مرغ نیمرو شده و کوچک (300- 50 میکرومتر) بعد از 5-1 روز روی محیط جامد می‌توان بطور قطع گفت که مایکوپلاسما هومینیس جداسازی شده است. کلنی‌ها با روش Dienes رنگ‌آمیزی می‌شود و این نوع رنگ‌آمیزی وضوح دیدن کلنی را بهتر می‌کند. هرچند که در خصوص مایکوپلاسما هومینیس با توجه به رشد سریع، مصرف آرژینین و تولید کلنی تخم‌مرغ نیمرو شناسائی بیشتر ضروری نیست، ولی شناسائی قطعی مایکوپلاسما هومینیس می‌تواند با بررسی اثرات بازدارندگی رشد با آنتی‌سرم‌های خاصی صورت بگیرد.

کلنی‌های کوچک اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم از آرتیفکت‌ها (مانند سلول پستانداران و دبریدهای سلولی و مواد موجود در سرم) به‌سختی متمایز می‌شوند. به‌همین دلیل کلنی‌های اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم باید تأیید شوند. برای این منظور بایستی توانائی اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم در مصرف اوره ارزیابی گردد. اگر محیط U آگار حاوی اوره و فنل‌رد استفاده شود، اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم روی آن تولید کلنی‌هایی با هاله قرمز می‌کند. کلنی‌های مشکوک اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم با تست اوره کلرید منیزیم تأئید می‌شود.

محیط افتراقی A7 شپرد و محیط‌های اصلاح شده A8 و A7B آگار دارای اوره می‌باشند و سویه‌های هیدرولیزکننده اوره را جداسازی می‌کنند و دیگر نیازی به استفاده از کلرید منیزیم برای دیدن کلنی نیســـــت. A7  آگار دارای سولفات منیزیم به‌عنوان عامل رسوب‌دهنده همراه با پنی‌سیلین (1 هزار واحد در میلی‌لیتر) و آمفوتریسین B (2/5 میکروگرم در میلی‌لیتر) می‌باشد. A7B افتراقی آگار همانند A7 آگار می‌باشد با این تفاوت که دارای پلی آمین پوتریسین دی هیدروکلراید (mm 10 ) برای افزایش رشد و تشدید رسوب روی کلنی می‌باشد. A8 افتراقی آگار دارای کلرید کلسیم (mm 1) به عنوان اندیکاتور کاتیونی دو ظرفیتی برای جداسازی تشکیل آمونیوم از اوره همراه با کلستین (7/5 میکروگرم در میلی‌لیتر)، آمپی‌سیلین (1میکروگرم در میلی‌لیتر) و آمفوتریسین B (2/5 میکروگرم در میلی‌‌لیتر) می‌باشد. در همه این 3 محیط مایکوپلاسما هومینیس بعد از 3-1 روز تشکیل کلنی‌های با ظاهر تخم‌مرغ نیمرو می‌دهد. کلنی‌های اوره آپلاسما اوره آلیتیکوم بعد از 3-1 روز تشکیل می‌شود که 50-15 میکرومتر قطر دارند. کلنی‌های اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم روی محیط A7B وA7 آگار سیاه می‌باشد، زيرا اکسید منیزیم روی آن رسوب کرده است، درحالی‌که کلنی روی محیط A8 افتراقی آگار طلائی یا قهوه‌ای روشن می‌باشد. چندین مطالعه نشان داده‌اند که محیط‌های A8،  A7Bو A7 به‌خصوص زمانی که با یک محیط مایع (مانند برموتیمول براث یا بوستون براث) به کار می‌روند، احتمالاً انتخاب مناسبی برای کشت مایکوپلاسماهای ژنیتال می‌باشند.

کلنی‌های تخم‌مرغی مایکوپلاسما  روی محیط PPLO آگار

 گزارش‌دهی نتایج کشت

          جداسازی مایکوپلاسما پنومونیه از افراد بیمار با عفونت تنفسی مهم می‌باشد، چرا که این باکتری نمی‌تواند جزء فلور دستگاه تنفسی باشد.

گزارش جداسازی گونه اوره‌آپلاسماها و مایکوپلاسما هومینیس مشکل است. جداسازی این باکتری از سایر نمونه‌های استریل معنی‌دار بوده، ولی اگر از سایر نمونه‌ها جداسازی شوند باید با شک به آن نگاه کرد و با روش‌های کمی تعداد باکتری‌ها ارزیابی شوند. مثلاً در اورتریت غیرگنوکوکی شاخص زیر باید در نظر گرفته شود:

CCU /ml      104(بخش تغییر رنگ) در میلی‌لیتر برای سوآب مجاری ادراری و CCU/ml 103 برای FVU. گزارش حضور گونه‌های اوره آپلاسما در سوآب سرویکس- واژن مشکل می‌باشد، چرا که به‌طور طبیعی آنها در این نواحی به فراوانی یافت می‌شوند. مایکوپلاسما هومینیس می‌تواند در واژینوز به تعداد بیشتر از CCU/ml 104 جداسازی شود. حضور بالای آن می‌تواند دلیلی بر عفونت دستگاه تناسلی باشد. در این موارد علائم کلینیکی و مطالعات باکتریولوژی باید انجام شود. حضور مایکوپلاسما در نمونه‌های نوزادان می‌تواند ناشی از آلودگی باشد. جداسازی مایکوپلاسما از نمونه‌های اندوتراکئال در تعداد بالا (بالای CCU/ml 103) بسیار مهم می‌باشد.

روش‌های رنگ‌آمیزی

رنگ‌آمیزی Dienes

Azure II     0.25g

Methylene blue      0.5g

Na2CO3    0.05g

Maltose        2g

Benzoic acid    0.04g

Distilled water      20ml

مواد فوق را در آب مقطر مخلوط نموده و بعد از صاف کردن، آن را هنگام استفاده به نسبت 1 به10 رقیق نمائید. این رنگ‌آمیزی به دو روش انجام می‌شود:

الف) در این رنگ‌آمیزی رنگ داینس مستقیماً روی سطح آگار ریخته می‌شود. این رنگ‌آمیزی غیراختصاصی فقط برای بهتر شدن وضوح کلنی‌ها در سطح آگار استفاده می‌شود. برای رنگ‌آمیزی ml 1 از رنگ داینس را روی سطح آگار می‌ریزند و سریعا” با آب مقطر رنگ را از سطح آگار شستشو می‌دهند. در مرحله بعد با اتانول 95 درصد، محیط رنگ‌زدائی می‌شود (1دقیقه اتانول روی سطح آگار باقی بماند) و سپس شستشو انجام می‌گیرد. بعد از خشک کردن، سطح پلیت با عدسی ×4 یا ×10 میکروسکوپ از نظر ظاهرکلنی‌ها بررسی می‌شوند. در این رنگ‌آمیزی سطح پلیت شفاف می‌باشد. تمام مایکوپلاسماها به جز مایکوپلاسما پنومونیه رنگی باقی می‌مانند، ولی مایکوپلاسما پنومونیه بعد از مدتی بی‌رنگ می‌شود. اوره‌آپلاسماها به رنگ آبی مایل به قرمز یا مایل به سبز و مایکوپلاسماها به رنگ آبی تیره و اطراف آن آبی شفاف دیده می‌شوند.

ب) روش دیگر این است که پس از رشد مایکوپلاسماها در سطح محیط جامد، یک لامل تمیز روی کلنی قرار داده و آن‌را فشار می‌دهیم تا کلنی کاملاً به لامل بچسبد. سپس لامل را برداشته و بر روی یک لام تمیز قرار می‌دهیم، بطوری‌که اثر کلنی روی لام مشخص باشد. لامل را از روی لام برمی‌داریم تا لام در حرارت اتاق خشک شود و سپس با لامل فیکس می‌کنیم؛ آنگاه از محلول آماده شده رنگ بر روی لام می‌ریزیم و به مدت 35 دقیقه نگه می‌داریم و پس از شستشو و خشک شدن با میکروسکوپ مشاهده می‌کنیم.

کلنی‌های مایکوپلاسماها با این روش رنگ خود را  تا دو روز حفظ می‌کنند، در حالی‌که تقریبا” تمام کلنی‌های سایر باکتری‌ها در مدت نیم ساعت رنگ خود را از دست می‌دهند.

رنگ‌آمیزی Crystal-fast violet

محلول استوک: حجم معینی از آب مقطر را با اسید استیک گلاسیال (5-1 قطره به ازای 100 میلی‌لیتر) به 7/3=pH می‌رسانیم. سپس یک گرم از پودر Crystal-fast violet را در 100 میلی‌لیتر آب‌مقطر حل کرده و 48 ساعت نگهداری می‌کنیم. به مدت یک دقیقه تکان می‌دهیم، فیلتر کرده و سپس مالتوز (7 گرم) را اضافه می‌کنیم.

محلول کار ( باید روزانه تهیه شود):

Stock solution     20ml

NaCl     0.05g

محلول فوق را به مدت یک دقیقه تکان می‌دهیم، فیلتر کرده و سپس مالتوز (7 گرم ) را اضافه می‌کنیم.

رنگ‌آمیزی به همان روشی که در مورد Dienes stain شرح داده شد، صورت می‌گیرد. کلنی‌های مایکوپلاسما و اوره‌آپلاسما هر دو به رنگ قرمز ارغوانی درمی‌آیند.

رنگ‌آمیزی Giemsa

قطعاتی از آگار محتوی کلنی را بر روی سطح یک لام برگردانیده و به مدت یک شب در محلول ثابت‌کننده بویون (Bouins fixative) قرار می‌دهیم؛ سپس بلوک را خارج کرده و لام را به‌مدت یک ساعت با آب جاری شستشو می‌دهیم. آنگاه لام را بر روی دو میله شیشه‌ای نگهدارنده در داخل یک پلیت قرار می‌دهیم و رنگ رقیق‌شده به نسبت 1 به 20 را به داخل آن می‌ریزیم. نمونه را به‌مدت یک شب به همین حالت می‌گذاریم سپس لام را شسته و پس از خشک نمودن، آن‌را با میکروسکوپ مشاهده می‌کنیم. در این روش مایکوپلاسماها به رنگ ارغوانی دیده می‌شوند.

رنگ‌آمیزی کلرید منگنز – اوره (Manganous Chloride-Urea)

این رنگ‌آمیزی برای کلنی‌های اوره‌آپلاسما اختصاصی می‌باشد و شامل ترکیبات زیر است:

اوره    1 g    

کلرور منگنز    g0/8

آب مقطر     ml100

محلول را بوسیله فیلتر استریل نموده و در مقادیر 4 میلی‌لیتر در لوله تقسیم می‌کنیم و در دمای 20- درجه سلسیوس  نگهداری می‌شود. پس از استفاده از معرف، باقیمانده آن باید دور ریخته شود.

طریقه مصرف:

   2-3 میلی‌لیتر از محلول را برروی پلیت دارای کلنی می‌ریزیم. پس از گذشت 1 تا 5 دقیقه در دمای اتاق، کلنی‌ها را با بزرگنمایی×40 بررسی می‌نماییم. در صورتی‌که کلنی مربوط به اوره‌آپلاسما باشد، به رنگ قهوه‌ای تیره دیده می‌شود. هیدرولیز اوره بوسیله اوره‌آز، تولید گروه‌های هیدروکسیل از آب می‌کند که این گروه‌های هیدروکسیل، کلرید منیزیم را اکسید می‌کند و در نتیجه اکسید منیزیم غیرمحلول تولید می‌گردد و به‌صورت رسوب‌های قهوه‌ای تیره روی کلنی در عرض چند دقیقه مشاهده می‌شود.

 آزمون‌های حساسیت ضدمیکروبی

امروزه تست‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی معمولی به تست‌های بر اساس اسید نوکلئیک برای ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک مانند tetM (شاخص مقاومت به tet) اضافه شده است.

آزمون‌های سرولوژی

در آزمایشگاه‌های کلینیکی انواع مختلفی از تست‌های سرولوژی جهت شناسائی سویه و گونه‌های مایکوپلاسما مورد استفاده قرار می‌گیرد. تست کلاسیک توصیه شده شامل آگلوتیناسیون سرد، ممانعت از هماگلوتیناسیون، آزمون همولیز، تست‌های ایمنوفلورسانس مستقیم و غیرمستقیم، میکروایمونوفلورسانس، آزمون بازدارندگی از رشد و متابولیسم توسط آنتی‌سرم و آزمون فیکساسیون کمپلمان با آنتی‌ژن‌های مایکوپلاسمائی می‌باشند. انواع دیگر تست‌ها که در بعضی موارد دارای حساسیت بالاتر می‌باشند و در تشخیص مایکوپلاسما بکار می‌روند عبارتند از: الیزا، EIA، ایمونوبلاتینگ، ایمنوباندینگ و تست‌های ایمنوپراکسیداز، استفاده از آنتی‌بادی‌های‌ پلی‌کلونال یا منوکلونال بدلیل حساسیت و اختصاصیت بالاتر این تست‌ها،  قادر به شناسائی سویه گونه‌های مختلف هستند.

فایده‌ای که تکنیک‌های ایمنوفلورسانس کلنی و ایمنوپراکسیداز ایمنوباندینگ دارند این است که قدرت تمایز گونه‌های خاص مایکوپلاسما در یک کشت مخلوط و يا قدرت تمایز ایزوله‌های اولیه را در محیط کشت دارند. هرچند بعضی مطالعات نشان می‌دهند که تعدادی از آنتی‌ژن‌های ایمنی غالب موجود در سطح سلولی مایکوپلاسما تحت تغییرات سریع در اندازه و فاز قرار می‌گیرند که این امر استفاده از آنتی‌بادی منوکلونال را در ایمنوبلاتینگ محدود می‌سازد.

آگلوتیناسیون سرد

در 50% موارد سرم مبتلایان به عفونت مایکوپلاسما پنومونیه محتوی ماده‌ایست که می‌تواند گلبول‌های قرمز گروه O انسان را در سرما (از 0 تا 4 درجه) آگلوتینه نماید. این آزمایش که بنام آگلوتیناسیون سرد نامیده می‌شود، اختصاصی نیست و ممکن است در سایر مواردی هم که بافت ریه آسیب می‌بیند مثبت باشد. عیار این آگلوتینین بتدریج افزایش یافته و در هفته‌های سوم و چهارم پس از شروع بیماری به حداکثر می‌رسد. عیار معادل یا بیش از 1:64 تائیدی بر تشخیص عفونت مایکوپلاسما پنومونیه می‌باشد. نکته دیگری که علت آن هنوز روشن نشده این است که سرم مبتلایان به پنومونی آتیپیک می‌تواند استرپتوکوک‌های MG را آگلوتینه نماید. از این آزمایش هم برای تشخیص استفاده می‌شود.

آزمون فیکساسیون کمپلمان

پاسخ آنتی‌بادی در پنومونی مایکوپلاسمائی به‌آسانی توسط فیکساسیون کمپلمان (CF) و واکنش سرم فاز حاد و مقاومت با باکتری کامل یا عصاره لیپیدی به عنوان آنتی‌ژن اثبات می‌شوند. این آنتی‌ژن را توسط کلروفرم و متانول از کشت مایکوپلاسما بدست می‌آورند. 4 برابر شدن تیتر آنتی‌بادی یا بیشتر، نشان‌دهنده عفونت فعال یا اخیر می‌باشد و این آزمون می‌تواند تیتر 4 برابر را در سرم بیمار پس از 3-2 هفته با یک تیتر بالاتر از 1:32 نشان دهد. هرچند که تیتر آنتی‌بادی بالا ممکن است اختصاصی نباشد، چرا که میزان نسبتاً بالای آنتی‌بادی برای حداقل 1 سال بعد از عفونت باقی می‌ماند.

مشکلاتی که آزمون‌های سرولوژیک بخصوص فیکساسیون کمپلمان دارد، عبارتند از:

1- تیتر فیکساسیون کمپلمان تا یکسال بعد از عفونت هم باقی می‌ماند.

2- آنتی‌ژن‌های گلیکولیپیدی که در این آزمون استفاده می‌شوند، برای مایکوپلاسماها غیراختصاصی هستند و در بافت‌های مختلفی مانند عضله قلب، مغز، پانکراس و برگ سبزیجات یافت می‌شوند. بنابراین نتایج مثبت کاذب در موارد پانکراتیک و سندرم‌های نورولوژیک دیده می‌شوند.

3- واکنش‌های مثبت کاذب در هر دو آزمون فیکساسیون کمپلمان و ELISA مشاهده می‌گردد. برخی از بزرگسالان فقط IgG می‌سازند، بنابراین آزمون فیکساسیون کمپلمان که اساسا” IgM را ردیابی می‌کند به احتمال زیاد منفی کاذب خواهد بود.

4- آنتی‌بادی‌های ایجاد شده برعلیه عفونت 7 تا 10 روز بعد از بیماری ظاهر می‌شوند، بنابراین این آزمون‌ها تست‌های مفیدی در تشخیص سریع بیماری نیستند.

5- نهایتا” اندازه‌گیری IgM عفونت کنونی را ثابت نمی‌کند، زیرا IgM برای ماهها باقی می‌ماند. بنابراین به‌جای عفونت کنونی می‌تواند یک عفونت قبلی را نشان دهد.

آزمون ممانعت از هماگلوتیناسیون

این آزمون را می‌توان بوسیله جذب آنتی‌ژن مایکوپلاسما روی گلبول‌های قرمز انجام داد. اساس این واکنش مبتنی بر پیوند غیراختصاصی گلبول‌های قرمز تعدادی از گونه‌های حیوانی و انسان، با کلنی انواعی از مایکوپلاسماهای انسانی است. در این روش معمولا” از اریتروسیت‌های گروه خونی o انسان، گوسفند، خوکچه هندی و ماکیان استفاده می‌شود. برای انجام این آزمون، آگار و یا قطعه‌اي از آن را بوسیله سوسپانسیون (V/V) 1% اریتروسیت‌های مزبور پوشانده و پس از نیم ساعت، سوسپانسیون اریتروسیتی را آسپیره کرده و سطح آگار را با محلول نمکی شستشو می‌دهیم. در این حالت نمونه تهیه شده برای مشاهده میکروسکوپی آماده می‌باشد. کلنی‌هایی از مایکوپلاسما که اریتروسیت‌ها را جذب می‌کنند، از نظر این آزمون مثبت محسوب می‌شوند.

 
مایکوپلاسما پنومونیه

آزمون همولیز

برخی از انواع مایکوپلاسماها بواسطه تولید پراکسید هیدروژن (H2O2)، قابلیت همولیز کامل و ناقص گلبول‌های قرمز گوسفند یا خوکچه هندی را دارا می‌باشند. در این روش، آگار یا قطعه‌ای از آن را بوسیله لایه نازکی از سوسپانسیون 8% اریتروسیت‌های حیوان پوشانده و پس از 24 ساعت یک منطقه کامل یا ناقص همولیز را در اطراف کلنی مایکوپلاسماها می‌توان مشاهده کرد. معمولاً همولیز کامل با ایجاد هاله زرد رنگ و همولیز ناقص با هاله سبز رنگ قابل تشخیص است. مثلاً مایکوپلاسما پنومونیه با اریتروسیت‌های گوسفند، همولیز کامل ایجاد می‌کند. مایکوپلاسما پنترانس در اثر هیدرولیز RBC های گونه‌های مختلف (گوسفند، اسب، جوجه و انسان)، رسوب قهوه ای ایجاد می‌کند که به‌دلیل اکسیداسیون هموگلوبین توسط کلنی‌های این باکتری است.

ایمونوفلورسانس غیرمستقیم (IFA)

این تست در شناسایی مایکوپلاسماها بخصوص در تشخیص مایکوپلاسما پنومونیه و مایکوپلاسما ژنیتالیوم، موقعی که بصورت مخلوط با هم دیده می‌شوند (زیرا از نظر سرولوژیک با هم واکنش متقاطع دارند) بکار می‌رود. ضمناً این تکنیک در مورد نمونه‌‌های اروفارنکس نیز که بیش از یک نوع مایکوپلاسما در آن وجود دارد، از اهمیت خاصی برخوردار است. این تکنیک همراه با ایمونوپراکسیداز قادر به تشخیص مستقیم کلنی‌های موجود برروی آگار بوده و جهت استفاده در محیط حاوی مخلوطی از گونه‌های مایکوپلاسما یا سروتیپ‌های اوره‌آپلاسما مفید می‌باشد که رنگ فلورسانس سبز را نشان می‌دهند.

آزمون ممانعت از رشد

در واقع دقیق‌ترین روش متوقف ساختن رشد باکتری‌ها با افزودن آنتی‌بادی اختصاصی و یا استفاده از دیسک‌های حاوی آنتی‌سرم روی محیط جامد است که با هاله عدم رشد باکتری مشخص می‌شود. آزمون ممانعت از رشد به همراه ایمونوفلورسانس کلنی روی آگار، بعنوان تکنیک‌های اختصاصی و سریع در شناسایی بیشتر گونه‌ها بخصوص اوره‌آپلاسما اوره‌آلیتیکوم و اسپیروپلاسما بکار می‌رود.

آزمون میکرو ایمونوفلورسانس

این تکنیک جهت تشخیص مایکوپلاسما پنومونیه و مایکوپلاسما ژنیتالیوم بکار رفته است، که حساسیت بیشتری در مقایسه با روش ممانعت از متابولیسم دارد. همچنین، آنتی‌بادی که با این روش اندازه‌گیری می‌شود، هیچگونه واکنش متقاطعی را بین مایکوپلاسما پنومونیه و مایکوپلاسما ژنیتالیوم نشان نمی‌دهد و در مقایسه با تست‌های دیگر مایکوپلاسما پنومونیه نیز کمتر واکنش می‌دهد.

تکنیک ELISA

استفاده از منوکلونال آنتی‌بادی در روش‌های ELISA، موجب توسعه جداسازی آنتی‌ژن‌های مولیکوتس‌ها از مواد بیولوژیکی و کشت‌ها بویژه در برخی از عفونت‌های حیوانات و گیاهان گردیده است، چرا که تعیین عوامل اتیولوژیکی این عفونت‌ها از طریق کشت بسیار مشکل است.

استفاده از تکنیک ELISA غیرمستقیم، بر روی نمونه‌های شیر جهت تشخیص ورم غدد پستانی ناشی از مایکوپلاسما بوویس در گاوهای ماده اهمیت دارد. اساس تشخیص عفونت‌های ناشی از مایکوپلاسما پنومونیه هنوز هم بر پایه پاسخ سرولوژیک می‌باشد، اما حساسیت و ویژگی بالای تکنیک EIA با هماگلوتیناسیون غیرمستقیم، بحث جایگزینی این تکنیک‌ها را بجای روش مرسوم ثبوت مکمل مطرح کرده است. تکنیک ELISA مزایای مختلفی دارد. از جمله اینکه قدرت سنجش هر سه کلاس آنتی‌بادی را دارا می‌باشد، در تعیین آنتی‌ژن‌های لیپوپروتئینی استفاده می‌شود و در تشخیص عفونت‌های ادراری – تناسلی بطور مکرر بکار می‌رود و به فراوانی کیت تست EIA در دسترس می‌باشد. امروزه ترکیب PCR اختصاصی مایکوپلاسما پنومونیه در آسپیره نازوفارنژیال با ایمنواسی (که IgM در آن گیر افتاده است) در سرم فاز حاد، تشخیص سریع آزمایشگاهی مایکوپلاسما پنومونیه را حساس‌تر می‌کند و ما را قادر می‌سازد که در طی یک یا دو روز جواب آزمایش را پاسخ دهیم. البته باید توجه داشت که تست‌های سرولوژیکی مثبت، گاهی در افرد سالم هم دیده می‌شوند، بنابراین فقط افزایش 4 برابر میزان آنتی‌بادی در تأئید بیماری دارای ارزش تشخیصی می‌باشد. ضمنا” مایکوپلاسما پنومونیه و مایکوپلاسما ژنیتالیوم دارای واکنش‌های متقاطع سرمی هستند.

ایمنوبلاتینگ

وجود شباهت بالای ژنومی بین مایکوپلاسما ژنیتالیوم و مایکوپلاسما پنومونیه سبب شده که واکنش‌های متقاطع سرولوژی در بین این دو پاتوژن انسانی رخ دهد. بنابراین تست میکروایمنوفلورسانس (MIF)،CF  و هماگلوتیناسیون غیرمستقیم (IHA) قدرت تمایز این دو گونه مایکوپلاسما را از همدیگر ندارند. امروزه برای تمایز این دو گونه مایکوپلاسما از همدیگر از تکنیک ایمنوبلاتینگ استفاده می‌گردد .

به هرحال کاربرد پروب‌های اختصاصی گونه PCR در روش‌های سرولوژی برای تمایز عفونت‌های مایکوپلاسما ژنیتالیوم و مایکوپلاسما پنومونیه قابل استفاده است.

نكته: در جمع‌بندی تست‌های سرولوژی بایستی گفت که امروزه اگرچه PCR بطور قابل‌ ملاحظه‌ای در تکنیک‌های آزمایشگاهی رسوخ پیدا کرده است، ولی تست‌های سرولوژی هنوز در تشخیص عفونت‌های مایکوپلاسما پنومونیه مهم می‌باشند. به‌خوبی مشخص شده که اندازه‌گیری تیتر آنتی‌بادی IgM جهت تشخیص عفونت در بچه‌ها استفاده می‌شود، زیرا آنها احتمالا” بیشتر با بیماری اولیه برخورد دارند. در بالغین آنتی‌بادی IgM به‌تنهائی تشخیص‌دهنده نمی‌باشد. استفاده از جداسازی سرولوژی آنتی‌بادی IgG و IgA هنوز یک روش انتخابی برای شناسائی عفونت حاد در بالغین باقی مانده است.

 روش‌های مولکولی

 امروزه به تست‌های کلاسیک برای شناسائی و طبقه‌بندی مایکوپلاسماها، انواع مختلفی از تست‌هاي مولكولي مانند آنالیز آنزیم محدودالاثر (REA) ژنوم مایکوپلاسما، AFLP، ريبوتايپينگ، انواع مختلف PCR (PCR معمولي، موئي، Multiplex، Nested، Real-time و غيره) اضافه شده است و در آزمايشگاه‌هاي باليني مدرن و تحقيقاتي مورد استفاده قرار مي‌گيرند.

تعیین حساسیت داروئی

 بدلیل تغييرات در حساسيت ضدميكروبي در بين مايكوپلاسماها، بايستي تست‌هاي تعيين حساسيت ضد ميكروبي در شرايط  in vitroانجام شوند. هرچند كه اين تست‌ها بدليل سخت‌رشد بودن باكتري در محيط‌هاي معمولي و نياز به محيط‌هاي اختصاصي، عدم وجود شرايط و زمان انكوباسيون استاندارد، نبود ميزان استاندارد تلقيح باكتري اوليه و نياز به تجهيزات گران‌قيمت در آزمايشگاه‌هاي باليني به‌صورت روتين انجام نمي‌شوند.