آنالیز اسپرم- 2

 

بررسی‌های میكروسكپی اولیه برای بررسی نمونه مایع منی بطور مستقیم (بدون رنگ‌آمیزی) با استفاده از میكروسكپ فازكنتراست توصیه می‌شود.

مخلوط كردن مایع منی و برداشتن نمونه از آن

در صورتی كه مایع منی به خوبی مخلوط نشود، برداشتن دو نمونه از قسمت‌های مختلف آن باعث می‌شود كه نتایج متفاوتی در میزان حركت، زنده بودن، غلظت و حتی مورفولوژی اسپرم حاصل گردد. مخلوط نمودن نمونه نباید آنقدر شدید باشد كه ایجاد حباب نماید. برای این‌كار از یك پی‌پت پلاستیكی یكبار مصرف استفاده نموده و آن را 10 بار در آن آسپیره می‌نماییم. قطر داخلی این پی‌پت باید حدوداً 1/5 میلی‌متر باشد. برای مخلوط كردن هرگز از ورتكس استفاده نكنید، زیرا باعث تخریب اسپرم‌ها می‌گردد. در صورتی‌ كه نمونه بخوبی مخلوط شده باشد، نتایج حاصل از تكرار آزمایش همخوانی خواهند داشت. برای ارزیابی هم‌خوانی نتایج از توزیع پواسون (poisson distribution) و توزیع دو جمله ای (binomial distribution) استفاده می‌كنیم كه شرح آنها در بخش‌های آینده خواهد آمد.

ابتدا با بزرگنمایی 100 (مثلاً عدسی 10 شیئی و 10 چشمی) موارد زیر را بررسی می‌كنیم:

– وجود رشته‌های موكوس

– تجمع (aggregation) و بهم چسبیدن (agglutination) اسپرم‌ها

– وجود سلول‌های غیر اسپرم مثل سلول‌های اپی‌تلیال و سلول‌های گرد(round cells) در نمونه، سلول‌های گرد شامل گلبول‌های سفید و سلول‌های زایای نابالغ (immature germ cells) می‌باشند.

گاهی ممكن است سرهای بدون دم و یا دم‌های بدون سر را نیز مشاهده نمود. سپس با استفاده از بزرگنمایی 200 یا 400 موارد زیر را بررسی می‌كنیم.

– ارزیابی حركت اسپرم‌ها

– مشاهده اسپرم‌ها و تعیین رقت مناسب برای شمارش صحیح آنها

تهیه لام مستقیم: ابتدا نمونه را بخوبی مخلوط نموده و قبل از این‌كه اسپرم‌ها ته‌نشین شوند، مقداری از آن را برای آزمایش برمی‌داریم. حجم نمونه‌ای كه برداشته می‌شود و لامل مورد استفاده باید استاندارد باشد، به نحوی‌كه فضای زیر لامل حدوداً 20 μm گردد. در این فضا اسپرم‌ها آزادانه حركت خواهند كرد. برای این كار حدود 10 μL از نمونه را روی یك لام تمیز قرار داده و آن را با یك لامل 22×22 می پوشانیم و سپس سریعاً بررسی می نماییم.

هنگام گذاشتن لامل باید دقت كرد تا حباب هوا در زیر لامل تشكیل نشود. نحوه محاسبه فضای زیر لامل تقسیم حجم نمونه (V) بر سطحی كه نمونه در آن پخش می‌شود (A) می‌توان عمق نمونه را در زیر لامل تعیین نمود.بدین‌ترتیب وقتی 10 μL از مایع منی را روی لام گذاشته و آن را با لامل 22×22 mm می‌پوشانیم عمق حاصل حدود20μm خواهد بود. گاهی ممكن است نیاز داشته باشیم كه عمق نمونه در زیر لامل بیشتر باشد، برای این‌كار 40 μm از نمونه را روی لام گذاشته و یك لامل 50×24mm ‌ روی آن قرار می‌دهیم. در این حالت عمقی حدود 33/3 μm خواهیم داشت.

توجه

1- اگر عمق نمونه در زیر لامل كمتر از 20 μm باشد، اسپرم‌ها دچار حركات چرخشی خواهند شد.

2- اگر عمق نمونه خیلی زیاد باشد، اسپرم‌ها دائماً از فوكوس خارج شده و ارزیابی آنها مشكل خواهد بود.  

3- در صورتی كه تعداد اسپرم‌ها در فیلدهای مختلف تفاوت زیادی با هم داشته باشد، نشانه آن است كه نمونه یكنواخت نمی‌باشد و در این‌ صورت باید آن را مجدداً مخلوط نموده و لام دیگری تهیه نماییم.

4- یكنواخت نبودن نمونه ممكن است ناشی از قوام غیرطبیعی، عدم سیالیت، چسبندگی یا تجمع اسپرم‌ها باشد.

تجمع اسپرم (aggregation): چسبیدن اسپرم‌های بی‌حركت به یكدیگر و یا چسبیدن اسپرم‌های متحرك به الیاف موكوس، سلول‌های غیراسپرم و یا ذرات دیگر را تجمع اسپرم (aggregation) می‌‌گویند.

بهم چسبیدن اسپرم‌ها(agglutination): زمانی است كه اسپرم‌های متحرك به یكدیگر چسبیده باشند. این چسبندگی ممكن است بین سرها، دم‌ها و یا مخلوطی از آنها باشد. اسپرم‌های بهم‌ چسبیده دارای حركات شدید می‌باشند، اما گاهی چسبندگی به شكلی است كه حركات اسپرم‌ها محدود می‌شود. بر اساس شدت آگلوتیناسیون (1 تا 4) و یا محل اتصال اسپرم‌ها به هم می‌توان طبقه‌ بندی‌های زیررا ارائه نمود.

بر اساس شدت چسبندگی

Grade 1) Isolated) : كمتر از 10 اسپرم در هر توده آگلوتینه وجود دارد و اكثر اسپرم‌ها آزادند

Grade 2) Moderate): حدود 10 تا 15 اسپرم در هر توده آگلوتینه وجود داشته و اسپرم‌های آزاد نیز وجود دارند

Grade 3) Large) : بیش از 50 اسپرم در هر توده آگلوتینه وجود دارد، اما هنوز هم تعداد كمی اسپرم آزاد دیده می‌شود

Grade 4) Gross): تمام اسپرم‌ها به هم چسبیده‌اند و توده‌های آگلوتینه بهم متصلند.

بر اساس محل چسبندگی

– چسبندگی با سر

– چسبندگی دم با دم. در این حالت سرها آزاد بوده و حركت می‌كنند.

– چسبندگی نوك دم‌ها با یكدیگر

– چسبندگی سرها با هم و دم‌ ها با همدیگر

– چسبندگی توده‌ای، كه سرها و دم‌ها در هم تنیده شده‌اند و دیگر بصورت مجزا دیده نمی‌شوند.

نكته 1: بهم چسبیدن اسپرم‌ها اگر چه می‌تواند نشانه وجود آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم باشد، اما دلیلی كافی برای ایمونولوژیك دانستن منشأ ناباروری نیست و نیاز به مطالعات تكمیلی دارد.

نكته 2: آگلوتیناسیون شدید می‌تواند در ارزیابی حركت و غلظت اسپرم تأثیر گذارد. سایر اجزاء سلولی در مایع انزالی ممكن است سلول‌های غیر از اسپرم وجود داشته باشند كه برخی از آنها دارای ارزش بالینی هستند. این سلول‌ها شامل سلول‌های اپی‌تلیال دستگاه ادراری– تناسلی و سلول‌های گرد (گلبول‌های سفید و سلول‌های زایای نابالغ) می‌باشند. با رنگ‌آمیزی اسمیر و بزرگنمایی 1000 می‌توان این سلول‌ها را شناسایی نمود. برای شناسایی دقیق‌تر این سلول‌ها می‌توان از رنگ‌آمیزی پراكسیداز یا تعیین آنتی‌ژن CD45 آنها استفاده نمود.

برای تعیین غلظت آنها می‌توان مثل شمارش اسپرم با استفاده از لام نئوبار آنها را شمارش كرد و یا اینكه با استفاده از یك اسمیر رنگ‌آمیزی شده و تعیین نسبت درصد آنها و دانستن غلظت اسپرم، تعداد آنها را محاسبه نمود.

 حركت اسپرم

 

هرچه تعداد اسپرم‌های متحرك بیشتر باشد، احتمال بروز حاملگی افزایش می‌یابد. روش‌های تعیین حركت اسپرم به كمك كامپیوتر(CASA) ذكر شده است. تحرك اسپرم را باید بلافاصله پس از سیال شدن مایع منی ارزیابی كرد. این زمان ترجیحاً 30 دقیقه پس از نمونه‌گیری است، اما در هرحال نباید از یك ساعت تجاوز نماید زیرا دهیدراتاسیون، تغییرات PH یا دما اثرات منفی بر تحرك اسپرم دارند.

برای بررسی تحرك اسپرم ابتدا نمونه را بخوبی مخلوط نموده و قبل از اینكه اسپرم‌ها ته‌نشین شوند، لام مستقیمی به عمق حدود 20 μm تهیه می‌كنیم. حدود یك دقیقه صبر نموده تا نمونه در زیر لام ساكن شود و سپس با بزرگنمایی 200X یا 400X آن را بررسی می‌نماییم. برای تعیین درصد اسپرم‌های متحرك حدود 200 اسپرم را باید ارزیابی نمود. با گرفتن یك لام مجدد از نمونه و تعیین دوباره اسپرم‌های متحرك می‌توان از صحت نتایج اطلاع حاصل نمود.

نكته: آزمایش را می‌توان در حرارت اتاق یا37⁰ انجام داد. در صورتی كه بخواهیم آزمایش در 37⁰ انجام شود باید علاوه بر نمونه، لام و لامل را هم در37⁰ قرار داد.

طبقه‌بندی حركت اسپرماتوزوئیدها

الف- اسپرماتوزوئیدهایی كه حركت پیشرونده دارند(PR) : اسپرم‌هایی كه در این گروه قرار می‌گیرند بطور فعالانه‌ای حركت می‌كنند. این حركت ممكن است در یك خط مستقیم و یا در یك مسیر دایره‌ای بزرگ ‌باشد و سرعت حركت اهمیتی ندارد.

ب- اسپرماتوزوئیدهایی كه حركت غیرپیشرونده دارند (NP) : شامل تمام حالاتی است كه اسپرم‌ها حركت پیشرونده ندارند. مثلاً ممكن است در یك مسیر دایره‌ای كوچك حركت نمایند یا اینكه فقط یك حركت فلاژلی جزئی داشته باشند، بطوری كه فقط سر یا دم آنها حركت نماید.

ج- بی حركت (IM): که اسپرم‌ها فاقد هرگونه حركت می‌باشند.

توجه:

1- در رده بندی قبل، اسپرم‌هایی كه حركت پیشرونده دارند، به دو دسته سریع و كند تقسیم می‌شدند و آنهایی كه سرعت حركت بیش از 25 µm/secجزء grade A طبقه‌بندی می‌شدند، ‌اما این نوع طبقه‌بندی برای تكنسین‌ها مشكل است.

2- وقتی تحرك اسپرم گزارش می‌شود، باید مشخص نماییم كه منظور حركت كل (PR+NP) است یا حركت پیشرونده (PR)

روش كار: برای بررسی تحرك اسپرم بهتر است از میكروسكپ فاز كنتراست و بزرگنمایی 200 X یا 400 X استفاده نمود. از نمونه، یك لام مستقیم به عمق 20µm تهیه نموده و صبر می‌كنیم تا نمونه ساكن شود. میدان‌های دید مختلف را بصورت رندوم بررسی نموده و 200 اسپرم را ارزیابی می‌كنیم. بهتر است اسپرم‌هایی را بررسی نماییم كه حداقل در فاصله 5 میلی‌متری از لبه لام قرار دارند.

این كار باعث می‌شود تا از اثر خشك شدن لام روی حركت اسپرم‌ها جلوگیری بعمل آید. ارزیابی تحرك اسپرم‌ها باید سریعاً انجام شود تا اسپرم‌های متحرك از میدان دید خارج نشده و یا وارد آن نگردند. بهترین كار استفاده از میكروسكپی است كه لنز چشمی آن بصورت شطرنجی تقسیم ‌بندی شده باشد. اگر غلظت اسپرم زیاد باشد، فقط ردیف بالای چهارخانه شطرنجی را بررسی می‌كنیم و در صورتی كه غلظت اسپرم كم باشد كل چهارخانه را مورد ارزیابی قرار می‌دهیم تا 200 اسپرم بررسی گردند. ابتدا اسپرم‌هایی كه حركت پیشرونده دارند (PR) و سپس آنهایی كه حركت غیرپیشرونده دارند (NP) را شمارش نموده و در آخر اسپرم‌های بیحركت (IM) را می‌شماریم.

البته با تمرین و كسب تجربه می‌توان هر سه را با هم شمارش كرد. برای شمارش اسپرم‌ها می‌توان از كانتر استفاده نمود. برای بررسی صحت كار یك لام مجدد از نمونه تهیه كرده و اسپرمهای PR، NP و IM را مجدداً شمارش می‌نماییم (در 200 اسپرم).

درصد هر گروه از اسپرم‌ها را در هر بار شمارش محاسبه نموده و میانگین درصد آنها و اختلاف بین دو شمارش را برای اسپرم‌های PR، NP و IM بدست می‌آوریم. اگر این اختلاف در حد قابل‌ قبول بود، میانگین درصدها را گزارش می‌كنیم و اگر غیر قابل ‌قبول بود، دو لام دیگر تهیه كرده و مجدداً شمارش را انجام می‌دهیم و به روش ذكرشده ارزیابی می‌كنیم.

تفاوت قابل قبول بین درصدها در دو بار شمارش 200تایی (مجموعاً 400 اسپرم شمارش شده‌اند): وقتی درصد اسپرم‌های PR، NP و IM را تعیین نمودیم عدد حاصل را به نزدیكترین عدد زوج گرد می‌نماییم، مثلا”32/5% را به 32% و عدد 3/5% را به 4% گرد می‌كنیم. سپس بیشترین میانگین را با جدول (1-2) مقایسه می‌نماییم.

به دو مثال زیر توجه نمایید:

مثال 1 – در نتایج حاصل از دو بار شمارش اسپرم اعداد زیر بدست آمده است:

همانطور كه مشاهده می‌شود بیشترین درصد مربوط به اسپرم‌های IM است. با توجه به جدول 1-2 برای میانگین 50% اختلاف شمارش تا 10% قابل‌قبول است و در این اندازه‌گیری چون تفاوت بین دو بار شمارش 30% بوده، لذا این اندازه‌گیری قابل‌قبول نبوده و مجدداَ باید انجام شود.

مثال 2- در نتایج حاصل از دو بار شمارش اسپرم اعداد زیر بدست آمده است:

 

همانطور كه قبلا ذكر شد اعداد 4/5% و 32/5% را به‌ ترتیب به 4% و 32% گرد می‌كنیم.

در این اندازه‌ گیری، بیشترین درصد مربوط به اسپرم‌هایPR  است.

برای میانگین 63% اختلاف شمارش تا 10% موردقبول است، لذا این اندازه‌گیری از صحت كافی برخوردار بوده و میانگین نتایج برایNP و PR و IM پس از گرد شدن اعداد ‌به عنوان جواب بیمار گزارش می‌گردد.

توجه:

1- در تعیین اسپرم‌های متحرك فقط اسپرم‌های سالم را در نظر بگیرید (یعنی فقط اسپرم‌هایی كه سر و دم دارند شمارش می‌شوند و اگر اسپرم متحرك بدون سرم مشاهده شد، جزء شمارش محسوب نمی‌گردد).

2- وجود اختلاف بین شمارش‌ها نشان‌دهنده آن است كه عمل مخلوط كردن یا برداشتن نمونه به‌ درستی انجام نشده و یا اسپرم‌ها بطور یكنواخت در سطح لام پخش نشده‌اند. در این حالت شمارش ر ا مجدداً با دو لام دیگر تكرار می‌كنیم. گاهی اوقات حتی در سومین شمارش نیز اختلاف حاصل قابل‌قبول نیست. در این حالت میانگین را حساب كرده و آن را در جواب بیمار خاطرنشان می‌كنیم.

3- چون از لحاظ ذهنی تمایل به شمارش اسپرم‌های متحرك بیشتر است، لذا بهتر است در لام دوم ترتیب شمارش را تغییر دهیم تا Bias ایجاد نشود، یعنی ابتدا IM و NP و سپسPR    را بشماریم. در صورتی‌ كه یك منطقه را برای شمارش و تعیین درصد اسپرم‌های متحرك انتخاب می‌كنیم و آنها را بطور مجزا می‌شماریم (یعنی ابتدا PR و سپس NP و IM باید توجه كرد كه ممكن است در شمارش به عدد 200 برسیم، اما هنوز یكی از این سه مورد را نشمرده باشیم یا كامل شمارش نكرده باشیم، در این صورت باید شمارش را ادامه داد (بیش از 200) تا همه گروههای PR و NP و IM كاملاً شمارش شوند.

مقادیر مرجع كمترین حد مرجع برای حركت كلی اسپرم (PR+NP) برابر 40% و برایPR به تنهایی 32% می‌باشد.