مدیریت امضاء- 6

 

ادامه از شماره قبل:

– آقای دكتر؛ آیا نمی‌توان به همان شیوه‌ای كه ویژگی RIBA افزایش یافته است، ویژگی الایزای HCV را هم افزایش داد تا نیاز به تست تأییدی كمتر شود؟ مثلاً با استفاده از آنتی‌ژن‌های اختصاصی‌تر این ویروس؟

– نخیر … در تكنیك الایزا، همه انواع آنتی‌ژن‌های مهم مربوط به ویروس هپاتیت سی را به طور یكجا و همراه با هم به دیواره چاهك چسبانده‌اند. در حالی كه در روش RIBA، آنتی‌ژن‌های مذكور را به طور جداگانه و با فاصله مشخصی بر روی یك نوار كاغذی از جنس نیتروسلولز نشانده‌اند … حال با توجه به همین اسلوب چینش آنتی‌ژن‌ها، به سادگی معلوم می‌شود كه چرا ویژگی RIBA یا همان وسترن‌بلات HCV در مقایسه با الایزای HCV افزایش می‌یابد. اینگونه اصول تركیبی و فضایی را در تست‌های دیگر آزمایشگاهی هم داریم.

– ممكن است توضیح بیشتری بدهید.

– اجازه بدهید یك مثال زنانه بزنم كه برای شما ملموس‌تر باشد.

– بفرمائید.

– تصور كنید كه درب یخچال منزلتان را باز می‌كنید و متوجه می‌شوید كه بوی تعفن و گندیدگی از غذاهای داخل آن می‌آید. آیا اولین كار كه قبل از شست‌وشوی یخچال می‌كنید این نیست كه محتویات یخچال را داخل سطل زباله بیندازید؟

– همه محتویات را نه. دنبال آن چیزی می‌گردیم كه فاسد شده است.

– ولی بوی گندیدگی تمام فضای یخچال را پر كرده است.

– وجود بو به تنهایی مهم نیست. باید معلوم كنیم بو از چه غذایی یا چه ظرفی است و همان را خارج كنیم.

– بسیار خوب. شما به همین سادگی سؤال مربوط به ویژگی بالاتر وسترن‌بلات در قیاس با الایزا را پاسخ دادید.

– چطور؟

– ببینید. وقتی یكی از چاهك‌های الایزا كه حاوی انواعی از آنتی‌‌ژن‌های مختلف HCV است تغییر رنگ می‌دهد، شما نمی‌توانید بگوئید كه آنتی‌بادی موجود در سرم بیمار برعلیه كدام جزء یا اجزاء ساخته شده است؛ بلكه اصلا” نمی‌توانید اثبات كنید كه آنتی‌بادی به طور اختصاصی به آنتی‌ژن مربوطه متصل شده است، زیرا ممكن است به صورت غیراختصاصی به دیواره پلاستیكی چسبیده باشد.

یك آنتی‌بادی برضد تنها یك نوع آنتی‌ژن ویروسی ممكن است همان رنگی را ایجاد كند كه سه نوع آنتی‌بادی برعلیه 3 نوع آنتی‌ژن ایجاد می‌كنند. حتی یك آنتی‌بادی می‌تواند به همان شدت تولید رنگ نهایی كند كه چند آنتی‌بادی می‌توانند … اما اگر آنتی‌ژن‌ها را از حالت مجموعه خارج كنید و آنها را به طور سواسوا روی یك نوار بنشانید، یعنی همان حالتی كه عملاً در وسترن بلات ایجاد شده است، آن وقت نه تنها اتصال غیراختصاصی را از اتصال اختصاصی افتراق می‌دهید (چون در اتصال غیراختصاصی انتظار می‌رود كه بخش‌های خالی روی نوار هم رنگ بگیرند) بلكه می‌توانید معلوم كنید كه بیمارتان مشخصاً برعلیه كدام آنتی‌ژن‌های انحصاری ویروس هپاتیت C، آنتی‌بادی ساخته است.

– … و این همان اصول تركیبی و فضایی است كه اشاره كردید؟

– بلی. در حقیقت گاهی اوقات با تبدیل یك ”مجموعه تام” به ”اجزای تفكیك شده” می‌توانیم ویژگی تست‌ها را افزایش دهیم. این یكی از اصول مهم علم آزمایشگاه است.

– ممكن است توضیح بیشتری بدهید!

– انگار همین توضیحات كافی نبود.

– می‌خواهیم مسئله كمی روشن‌‌تر شود.

– من در حضور شما دو نفر به یاد دوران تحصیل می‌افتم.

– چطور؟

– … فعلاً كه در حسرت نسیم خوش بهاری بیرون این اتاق هستم. حیف آن همه شكوفه و چمن و طراوت هوای بعد از باران نیست كه از پشت پنجره ما را به تنفس می‌خواند؟

( توضیح: زمان این مصاحبه به اواخر فروردین امسال باز می‌گردد)

ولی از طرف دیگر فضای این سالن مرا به یاد شاگردی می‌اندازد كه مشق و درسش را حاضر نكرده و الان باید جلوی معلم جواب پس بدهد. سؤالات شما مثل مصاحبه‌های استخدام است یا مصاحبه‌های گزینش دانشجو بعد از كنكور.

– خود من بدون اغراق، حالت كودك كنجكاوی را دارم كه با حیرت كودكانه به دنیای اطراف می‌نگرد. ما چون با دوستان خودمان در آزمایشگاه‌ها مرتبطیم و فكر می‌كنیم درباره مسائل مختلف آزمایشگاه بحث می‌شود، وارد جزئیات می‌شویم.

– بلی. ولی اینها كلیاتی است كه در درس ”مقدمات آزمایشگاه” به آن پرداخته می‌شود.

– ما كه در دانشگاه علوم پزشكی … درس خوانده‌ایم آن هم با حضور بهترین اساتید و خیلی هم ادعا داشتیم، از این خبرها نبود.

– البته این مشكل تا حد زیادی به وسعت زیاد علم آزمایشگاه مربوط می‌‌شود و از طرفی به محدودیت زمان تحصیل.

– اما در مقطع كارشناسی نیز چیز اضافه‌تری نیاموختیم. می‌توانستند به جای آموزش دروس تكراری، از تست‌های نوین و تفسیر آنها و از تكنیك‌های جدید و از حساسیت و ویژگی و ارزش اخباری هم بگویند یا به قول شما از مقدمات آزمایشگاهی و از دیگر اصول آزمایشگاهی.

– آنچه كه اشاره می‌كنید از معضلاتی است كه رشته علوم آزمایشگاهی بالاخص در مقطع كارشناسی با آن روبروست و متأسفانه با تكراری شدن واحدهای درسی موجب تلف شدن ایام تحصیلی دانشجویان علاقمند و با استعدادی شده است كه وارد این رشته شده‌اند، اما امیدواریم با مقررات جدید رفع شود.

– منظورتان معرفی دوره جدید كارشناسی پیوسته علوم آزمایشگاهی است؟

– بله. سرفصل دروس تا حدودی تغییر كرده است. البته درس مقدمات آزمایشگاهی حذف شده، ولی واحدهای جدیدی نیز اضافه شده است.

– واحد مدیریت امضاء‌ هم هست؟! … (سكوت حضار!) … صحبت من از سر شوخی نبود. از روی دلسوزی و صداقت عرض كردم. در سطح كشور، تعداد زیادی از جواب‌های آزمایش توسط كاردان و كارشناس امضاء می‌شود، حتی در بخش خصوصی. در بخش‌های دولتی كه بیشتر و بیشتر. چه اشكال دارد كه واحدهای مدیریتی به ما آموزش داده شود.

– … به هر حال، در این برنامه جدید آموزشی جمعاً 130 واحد ارائه می‌شود (در قالب حدود 20 واحد عمومی و 30 واحد پایه و حدود 60 واحد اختصاصی و چهار دوره كارآموزی و كارورزی).

– از ما كه گذشت، ولی امیدواریم دانشجویان جدید این رشته دچار تكرار مكررات نشوند.

– ان‌شاء‌ا…

البته به كوریكولوم فعلی (سرفصل دروس جدید) نیز ایراداتی وارد است. مثلاً جای 1 واحد درس منطق (خواه منطق قدیم و خواه منطق جدید) كه بتواند قوه استدلال و نظام تفكر یك دانشجوی علوم آزمایشگاهی را پرورش دهد، خالی است. نه تنها دانشجوی علوم آزمایشگاهی، كه دانشجوی پزشكی نیز بدون این دستمایه‌ها- كه متأسفانه و علی‌الظاهر خاص رشته علوم انسانی تصور می‌شوند- وارد بازار كار می‌شود.

در تنظیم كوریكولوم فعلی، نظر انجمن‌های علمی رشته‌های آزمایشگاهی و مسئولین آزمایشگاه‌ها كه بهره ‌گیرندگان اصلی و نهایی از این پرورش‌یافتگان دانشگاهی هستند، لحاظ نشده است. خلاصه به نظر نمی‌رسد كه از آراء ”صاحبان فرآیند” به خوبی پرس‌وجو شده باشد. اگر عرق رشته خود را دارید، پیشنهاد می‌كنم مصاحبه‌ای با آقای دكتر میرمجید مصلایی را ترتیب بدهید و در مورد ظرایف تحصیلی این رشته و نقاط ضعف و قوت آن سؤال بپرسید. حتی می‌توانید اطلاعات بیشتری راجع به وضعیت این رشته جدید از دست‌اندركاران معاونت آموزشی وزارت بهداشت كسب كنید.

– حتما.ً موضوع را به سردبیر اعلام می‌كنیم …

اما مثال‌هایی در مورد تفكیك كل به جزء و افزایش ویژگی می‌فرمودید در وسترن‌بلات.

– وسترن بلات، وسترن بلاط؛ حیف از آن نسیم فرحبخش روی حیاط!

همانطور كه عرض كردم با تبدیل یك مجموعه تام از تست‌های آزمایشگاهی به اجزاء تفكیك شده و اعضاء منفرد، می‌توان انتظار داشت كه ویژگی آن تست‌ها افزایش یابد. من چند مثال را می‌زنم. شما یكی را برای چاپ انتخاب كنید. بگذارید از تست‌های بیوشیمی شروع كنیم. مثلاً در مورد تفكیك Total cholesterol به كلسترول‌های HDL و LDL و VLDL.

می‌دانیم كه ارزش تست‌های منفرد در یك پانل لیپیدی، بسیار بیشتر از اندازه‌گیری كلسترول تام است. مولكول‌های كلسترول در این مجموعه‌ها پراكنده است و نمی‌توان اختلالات متابولیسم لیپیدها و لیپوپروتئین‌ها را از روی كلسترول تام تشخیص داد، ولی تست‌های مربوط به اندازه‌گیری كلسترو‌ل‌های HDL و LDL به صورت تفكیك شده، دارای ویژگی بالاتری است چرا كه در بین لیپوپروتئین‌ها، بیشترین درصد كلسترول در LDL وجود دارد، ولی بیشترین درصد تری‌گلیسیریدها در شیلومیكرون به طوری كه تنها 20 تا 25 درصد از شیلومیكرون‌ها را كلسترول تشكیل می‌دهد. همین تفاوت‌ها در تست‌های آزمایشگاهی، بر تصمیم‌گیری‌های درمانی نیز تأثیر دارد به طوری كه در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2، هدف درمانی ایده‌آل عبارتست از كاهش كلسترول LDL مثلاً به كمتر از mg/dL100 و یا در مبتلایان به بیماری كرونر، پزشك با سنجش اولیه كلسترول‌های HDL و LDL به عنوان حد پایه، تصمیم خود را برای كاستن از نوع LDL و افزودن بر HDL استوار می‌كند. پذیرفتید؟

– بلی.

– مثال دیگرم در حوزه باكتریولوژی و در مورد كشت مدفوع است كه بر روی محیط جامد آگار انجام می‌شود. می‌دانید چرا؟

– چون باید نوع كلنی را مشخص كرد كه آیا تخمیركننده لاكتوز است (LF) یا بیماری‌زا است و غیرتخمیركننده لاكتوز (NLF).

– و اگر نمونه را در آبگوشت تلقیح كنیم چه؟

– فقط كدورت داریم و نوع كلنی را تشخیص نمی‌دهیم.

– آفرین. اصلاً كلنی نداریم. باكتری‌ها آزادانه شناورند. فقط می‌دانیم كه باكتری‌هایی رشد كرده‌اند، ولی نمی‌دانیم چه نوعی. به عبارت دیگر ویژگی تست ما پائین است و برای افزایش ویژگی، باید آن اجزاء را و آن همه انواع میكربی را از هم تفكیك كنیم به كمك یك محیط جامد.

همینطور است در كشت خون كه وقتی ویال مربوطه تغییر رنگ داد یا همولیز داشت یا لخته‌ای در آن پیدا شد یا رسوباتی داد و یا حباب هوا تشكیل شد و … و خلاصه یكی از معیارهای رشد باكتری را نشان داد در آن حالت تست ما مثبت شده است، ولی ویژگی بالایی ندارد كه بتواند مشخص كند یك میكروب‌ گرام منفی عامل عفونت بوده است یا گرام مثبت. كوكوس بوده است یا باسیل. ممكن است حساسیت كافی داشته باشد، ولی ویژگی مطلوبی ندارد. چاره كار در قدم بعدی است یعنی بردن نمونه روی آگار و انجام تست‌های تكمیلی و ویژه‌تر. قضیه روشن شد؟

– بلی. كاملاً.

– حالا یك مثال دیگر می‌زنم! در حوزه ایمونولوژی و درباره گلبولین‌‌های α و β و γ بدون ایمونولوژی صفا ندارد!

– پس در مورد هماتولوژی هم مثال بزنید.

– مثال هماتولوژی كه دم دست است و خودتان هم می‌توانید جواب دهید.

– شما بفرمائید.

– همان اولی‌ترین و رایج‌ترین تست خون‌شناسی است.

– یعنی سی‌بی‌سی؟

– بلی. ارزش diff. count بیشتر از Total count است، چرا كه در اینجا هم با تفكیك كل به جزء، ویژگی تست خیلی زیادتر می‌شود …

– … و آنچه كه در شمارش تام ممكن است مخفی باشد در شمارش افتراقی آشكار می‌شود.

– درست است.

– بسیار خوب، از ایمونولوژی بفرمائید.

– آن قدیم ‌قدیم‌ها كه ما كوچکتر از این سن و سال بودیم و تازه وارد دانشگاه شده بودیم …

– چه سالی؟

– شما متولد چه سالی هستید؟

– حدوداً 1365

– بله. حدوداً كمی قبل از تولد شما. آزمایش الكتروفورز آنچنان رایج نبود و گاهی بررسی پروتئین‌های سرم را براساس اندازه‌گیری آلبومین و گلوبولین به تفكیك انجام می‌دادند كه اندازه‌گیری گلوبولین‌ و راكسیون‌های فلوكولاسیون هر چند روش‌های ساده‌ای بودند، ولی در حال منسوخ شدن بودند و عمدتاً با اندازه‌گیری پروتئین توتال و آلبومین و تفریق این دو از هم، مقدار گلوبولین را تخمین می‌زدند كه ویژگی بالایی نداشت. من شاید حداكثر یك بار تست گلوبولین را در دوران دانشجویی انجام داده باشم، ولی اگر اشتباه نكنم روش آزمایش در دو كتاب قدیمی گرادوول (Gradwohl) و كتاب روش‌‌های آزمایشگاهی آقای دكتر وزیری كاشانی درج شده باشد.

– من هر دو كتاب را دیده‌ام. خیلی قدیمی‌اند. مربوط به 20 یا 30 سال پیش هستند و از رده خارج‌اند.

– بله. ولی بدانید كه قدیمی بودن همواره دلیل بر منسوخ شدن كامل آنها نمی‌شود.

– اما اگر تجدید چاپ نشوند، مرده به حساب می‌آیند.

– به عقیده من، در حوزه كارهای عملی و پراتیك (پركتیكال)، گاهی همان كتاب‌های قدیمی كارگشاتر از كتاب‌های روز هستند. كتاب مرحوم آقای دكتر وزیری كاشانی تا اواسط دهه 60 خورشیدی توسط انتشارات چهر چاپ می‌شد و انصافاً در زمان خودش كه هنوز اتوآنالایزرهای بیوشیمی در تمام كشور رواج نیافته بودند، یا آزمایش‌های هماتولوژی در غیاب سل‌كانترها به روش دستی انجام می‌شد، از نظر تكنیكال، مرجع پرمراجعه‌ای برای آزمایشگاه‌های عمومی بود. شما كه اصحاب رسانه هستید باید بیش از امثال ما، به صاحب‌قلمان بها بدهید و از آنها قدرشناسی كنید. هر چیزی را باید در context و در ظرف زمانه خودش دید. ظاهراً مرحوم دكتر وزیری كاشانی از معدود آزمایشگاهیانی بوده است كه زمینه تحصیلات عمومی و تخصصی دانشگاهی ایشان، انحصاراً در رشته علوم آزمایشگاهی بوده و چه بسا اگر متعاقب سانحه‌ای كه در جاده شمال برای او پیشامد كرد، دچار ناتوانی نمی‌شد، علیرغم كهولت سن می‌توانست باز هم كتاب تجدید نظر شده‌ای را عرضه كند. بسیاری از تحصیل‌كردگان قدیم باید خود را وامدار چنان كتاب‌هایی بدانند. هرچند با توجه به علوم امروزی، كتاب‌هایی دمده و مشحون از غلط به حساب بیایند.

بخش‌های زیادی از كتاب دو جلدی گرادوول به عنوان مجموعه‌ای از دستورالعمل‌های قدم به قدم، هنوز هم شایستگی تدریس به عنوان یك درسنامه آزمایشگاهی در شرایط فعلی كشورمان را دارد … و افسوس كه بعد از تجدیدنظر هشتم این دائره‌المعارف ارزشمند آزمایشگاهی در سال 1980، از دیدن چاپ‌های بعدی آن محروم شدیم.

– آقای دكتر؛ در عمق نگاه شما بازگشت به خاطرات معلوم است و با یك حس نوستالژیك از گذشته صحبت می‌كنید.

– درست متوجه شدید. یاد ایام ماضی كردم!

من این توفیق را داشته‌ام كه دوران دانشجویی را در كلاس خوبی سپری كنم. محیط خوب، نعمت خیلی بزرگی است. نعمت حشرونشر با همكلاسان خوب كه مشوق همدیگر بودند، نه بازدارنده و استفاده از محضر استادان گرانقدر كه همه آنها خاطره است. آشنایی من با كتاب گرادوول با معرفی استاد عزیزم آقای دكتر محمدجواد ثابت جهرمی بود كه این كتاب را -آن طور كه معروف است- انجیل آزمایشگاهیان می‌نامیدند و ضمن تدریس بیوشیمی عملی، نكات آزمایشگاهی زیادی را از آن كتاب یا از بروشورهای كیت‌های بیوشیمی رایج آن زمان كه عمدتاً كیت‌های وارداتی مثل Merck آلمانی و Sigma آمریكایی و بیومریوی فرانسوی بود برایمان زیراكس می‌كردند و به آزمایشگاه می‌آوردند و به انگلیسی‌خوانی هم تشویقمان می‌كردند. نمی‌دانید كه چه نكات فنی و تجربی مهمی لابلای بروشورها نهفته است! همینجا بگویم كه جای 1 یا 2 واحد درس ”بروشورخوانی” در بین واحدهای اختصاصی رشته علوم آزمایشگاهی خالی است … و چه درس مفیدی می‌شد این درس!

مرور بروشور كیت‌های بیوشیمی، بروشورهای ایمونولوژی، خون‌شناسی و … و دانستن اجزای هر بروشور.

حتی می‌توانست هنر SOP نویسی -كه همگان از آن می‌گریزند- را برای آزمایشگاهیان ساده‌تر كند.

باری، در همان سال‌ها، جهاد دانشگاهی كتاب گرادوول را افست كرده بود و ما نیز به تشویق استاد، آن را خریدیم و بیشتر و بیشتر با آن گنجینه معتبر انس گرفتیم و كار به جایی رسید كه به كمك همكلاسان، قسمت‌هایی از آن را حتی غیر از مبحث بیوشیمی ترجمه كردیم … هر چند به سرانجامی نرسید.

… و از این جهت بود كه تأمل ایام گذشته می‌كردم و بر عمر رفته تأسف می‌خوردم! این حرف‌های ایام شباب را كه ضبط نمی‌كنید؟

– ضبط كه می‌شود ولی بعداً قسمت‌های اضافه را حذف می‌كنیم. شما بفرمائید.

– صحبت دیگری ندارم.

– آقای دكتر محمدی؛ بحث گلوبولین‌ها به كجا رسید؟

– معذرت می خواهم. در مورد مثال گلبولین‌ها می‌خواستم اشاره كنم كه اندازه‌گیری مجموعه گلوبولین‌ها به عنوان یك واحد، مثل آن طوری كه در گذشته انجام می‌شده، ارزش چندانی ندارد و لذا برای افزایش ویژگی این تست و بهره‌ برداری بیشتر از آن، همان قانون ”تفكیك كل به جزء” اعمال شد، به نحوی كه امروزه ویژگی اجزاء آلفا و بتا و گاما برای شما روشن است: تغییرات در محدوده گاما عمدتاً مختص كاركرد لنفوسیت‌هاست و تغییرات در محدوده آلفا و بتا عمدتاً نشانه كاركرد كبد.

– افزایش در ناحیه گاما می‌تواند نشان‌دهنده بدخیمی لنفوسیت‌ها و مولتیپل‌میلوما باشد.

– به شرط آن كه به صورت مونوكلونال باشد، ولی اگر پلی‌كلونال شود، صرفاً بیانگر افزایش تولید توسط لنفوسیت‌هاست.

– … یا نشانه بیماری‌های مزمن كبدی.

– كاملاً درست است. مثلاً در سیروز یا برخی دیگر از بیماری‌های مزمن كبد،‌ به دلیل ناتوانی كبد در پاكسازی آنتی‌ژن‌های باكتریال روده‌ای كه وارد خون شده‌اند، افزایش تحریك سیستم ایمنی را داریم و زیاد شدن سطح گاماگلوبولین‌ها رخ می‌دهد.

– در سیروز، باكتری‌های روده وارد خون می‌شوند؟

– در همه افراد باكتری‌ها وارد خون می‌شوند. در بدن همه انسان‌های سالم روزانه تعداد اندكی باكتری روده‌ای همزمان با جذب غذا وارد عروق می‌شوند و میزان كمی باكتریمی به وجود می‌آید كه عمدتاً در مسیر ورید پورت است، منتها توسط ماكروفاژهای كبد به دام می‌افتد و باقیمانده آنها هم توسط سیستم ایمنی سالم سركوب می‌شوند. ورود این حد از باكتری‌ها به دنبال مسواك زدن هم عادی است.

– یعنی بعد از مسواك زدن یا غذا خوردن، كشت خون ما مثبت می‌شود؟

– این باكتریمی در آن حد نیست و از آستانه حساسیت‌ سنجشی محیط كشت‌های معمولی پائین‌تر است، ولی گاهی اوقات مثبت شدن كشت هم بعید نیست. این از همان مواردی است كه بر ویژگی كشت خون اثر می‌گذارد و پزشك باید با توجه به وضعیت بالینی بیمار و تعداد روزهای سپری شده بین خونگیری تا مثبت شدن جواب و برحسب نوع میكرب ایزوله‌شده، تصمیم بگیرد. بگذریم.

برای آن كه ویژگی اندازه‌گیری گلبولین‌ها از آن حد قبلی هم فراتر رود، شما می‌توانید مجدداً ”تفكیك كل به جزء” را انجام دهید. مثلاً با اندازه‌گیری كلاس‌ها (ایزوتیپ‌ها) و ساب‌كلاس‌های ایمونوگلوبولین‌ها.

– آقای دكتر؛ آیا مشابه ویژگی، برای افزایش sensitivity یا حساسیت هم قانون یا اصلی وجود دارد؟

– بفرمائید قوانین و اصول. این اصل تفكیك كل به جزء و آن قاعده افتراقی فضایی و سه بعدی كه برای افزایش ویژگی گفته شد و مثلاً در فلوسیتومتری صادق است، تنها دو مورد از اصول است. برای افزایش حساسیت هم اصول و پارامترها و شرایطی وجود دارد.

– ممكن است آن اصول را بگوئید … یا حداقل بعضی از آنها را.

– گوئیا تمام شدنی نیست، این بعدازظهر طولانی!

– از دو ساعت چیزی بیشتر نشده است …

– حساسیت یا sensitivity نیز با تمهیداتی قابل ترقی است. در رأس آنها سه اصل تغلیظ و تكثیر و تلحیم است یا Concentration و Amplification و Augmentation.

با توجه به اصل تغلیظ، در آزمایشگاه سعی می‌كنیم در صورت امكان عوامل مورد جستجو در نمونه بیمار را كنسانتره كنیم. مثلاً در انگل‌شناسی به كمك روش‌های شناورسازی (فلوتاسیون) حساسیت آزمایش S/E را از نظر O&P بالا می‌بریم. یا در باكتر‌ی‌شناسی باید لوله حاوی نمونه CSF را قبل از كشت دادن سانتریفوژ كرد. اگر گفتید لوله با پنبه یا بدون پنبه؟ …

… جواب صحیح ”با پنبه و چسب نواری” است، آن هم در لوله‌های كوتاه نه بلند.

– چرا؟

– كمی فكر كنید.

در بخش بیوشیمی و در آزمایشگاه سم‌شناسی یا موادمخدر برای انجام یك كروماتوگرافی خوب (چه كاغذی و چه TLC)، باید در ابتدا نمونه ادرار را با حلال‌های آلی یا به كمك رزین استخراج و تبخیر و تغلیظ كرد. هر چه حجم ادرار اولیه بیشتر باشد، محصول تغلیظ شده بیشتری حاصل می‌شود و حساسیت بالاتر می‌رود. به این صورت شما یك تست مثل كروماتوگرافی را كه فی‌نفسه ویژگی بالایی دارد، از نظر حساسیت هم بهتر می‌كنید.

حالا بگوئید آیا حساسیت آزمایش میكرسكپی U/A بر روی نمونه ادرار 24 ساعته بیشتر است یا نمونه‌ای كه در لیوان ادراری معمولی گرفته شده است؟

– ظاهراً ادرار 24 ساعته حجم بیشتری دارد.

– باید حواستان به سؤال‌های انحرافی باشد!

برای آزمایش U/A اولاً باید نمونه تازه باشد. در ثانی، حجم ادرار اولیه یا حجم Specimen هر چقدر كه باشد، ما فقط 10 سی‌سی از آن را به عنوان Sample برمی‌داریم و معیار اندازه‌گیری سلول‌ها و بلورها و سیلندرهای تغلیظ شده، همان چیزی است كه در حجم cc10 پخش بوده است.

اما اصل دوم؛ در روش Amplification یا تكثیر، چنانچه ماده یا عامل مورد جستجو قابل افزایش از نظر تعداد و مقدار باشد، ‌به افزایش حساسیت تست كمك می‌كند، مثل روش PCR كه می‌تواند از یك قطعه ژنومی، ده‌ها میلیون قطعه مشابه یا amplicon بسازد. در برخی اهداء‌كنندگان ناقل هپاتیت B، مقدار HBsAg در خون آنقدر كم است كه با روش‌های الایزای موجود قابل شناسایی نیست، ولی چون بیم آن می‌رود كه گیرندگان خون اهدایی را آلوده كند، از روش‌های تشخیصی حساس‌تری در دنیا استفاده می‌شود كه به NAT موسوم است (تكنیك یا تست آمپلیفیكاسیون اسیدهای نوكلئیك) كه منظور از آنها، همین تست‌های خانواده PCR‌ و مشابه آن است.

اینگونه سیستم‌های تقویتی را در دستگاه‌های آزمایشگاهی یا در متدهای تشخیصی همچون الایزا هم داریم، یعنی به كار بردن روشی كه بتوان سیگنال‌های ضعیف را تشدید كرد و شناسایی نمود، مثلاً با استفاده از تركیبات بیوتین و آویدین كه هر یك مولكول پروتئین آویدین می‌تواند تعداد 4 مولكول بیوتین را به خود متصل كند و با تجمیع كونژوگه‌های مربوطه، رنگ تولید شده در الایزا و یا حتی نور كمی لومینسانس را افزایش دهد كه باعث تقویت حساسیت كیت می‌شود و یك تكثیر مجازی محسوب می‌شود. این هم از اصل دوم.

كلمه ”تلحیم” به معنی فربه كردن یا گوشتالود كردن و پرمایه ساختن است. گاهی در آزمایشگاه می‌توانیم ”حجم” بیشتری از نمونه بیمار را در پروسه آزمایش وارد كنیم یا ”زمان” بیشتری را برای جستجو صرف كنیم.

– لطفاً مثالی بزنید.

– چون از الكتروفورز صحبت كردم، اجازه بدهید از همین تكنیك هم مثال بزنم.

در الكتروفورز رایج ایران، كه الكتروفورز روی استات سلولز است، مقدار نمونه مورد استفاده خیلی كم است، حتی كمتر از یك لاندا یا یك میكرولیتر. یك لاندا معادل چند میلی‌لیتر مكعب بود؟!

– این یكی را فراموش نكرده‌ایم! یعنی یك میلیمتر مكعب (به اخبار آزمایشگاهی شماره ……… نگاه كنید.)

– درست می‌فرمائید. چند برابر این مقدار مثلاً در حد 3 تا 7 میكرولیتر را (برحسب ژل مورد استفاده و كارخانه سازنده) در روش الكتروفورز روی ژل استفاده می‌كنیم كه همین مسئله موجب می‌شود حساسیت روش دوم چندین برابر افزایش یابد و باندهای قوی‌تری را در ژل ببینیم علی‌الخصوص این كه ژل را پس از رنگ‌آمیزی، آبگیری و خشك می‌كنیم كه همین كار هم به تراكم و تغلیظ توده‌های پروتئینی در هر ناحیه كمك می‌كند. نقش این افزایش حساسیت و تأثیر نوع رنگ‌آمیزی بر حساسیت باز هم بیشتر و بیشتر الكتروفورز روی ژل موجب شده است تا از تكنیك روی ژل به وفور در كارهای تحقیقاتی و در پروژه‌هایی كه فرضاً روی آنتی‌بادی‌ها انجام می‌‌شود، استفاده شود تا مقادیر جزئی از هر پروتئینی را به خوبی نشان دهد. همچنین استفاده از رنگ آمیزی‌های حساستر مثلاً استفاده از آمیدوبلك و كوماسی‌بلو به جای تركیبات پونسو یا استفاده از رنگ آامیزی نیترات نقره، حساسیت سنجش را باز هم افزایش می‌دهد.

– ممكن است مثال ملموس‌تری از كارهای روزمره آزمایشگاه بزنید.

 مثلاً‌برای تشخیص مالاریا می‌توانیم به جای استفاده از یك قطره كوچك خون و تهیه اسمیر نازك از آن، حجم بیشتری مثلاً به اندازه دو قطره بزرگ استفاده كنیم و به جای فروتی معمولی، یك thick film داشته باشیم.

در همین آزمایش مالاریا، می‌توان برای اطمینان كامل در رد موارد مشكوك، زمان مشاهده میكروسكوپی لام را – كه به طور قراردادی 10 دقیقه برای اسمیر نازك به توصیه WHO می‌‌باشد- به چند دقیقه بیشتر افزایش داد و به این صورت، sensitivity بررسی میكروسكوپی را زیادتر كرد.

– ما برای CBC بیماری كه WBC خیلی كم داشته باشد، مجبوریم مدت diff میكروسكوپی را زیاد كنیم، یعنی افزایش زمان جستجو.

– البته این مثال شما مثال خوبی است و به ارتقاء حساسیت مربوط می‌شود، ولی تذكر دهم كه بیش از آن كه در راستای موضوع افزایش حساسیت باشد، به افزایش صحت و دقت یعنی تكرارپذیری شمارش افتراقی در افراد مبتلا به لكوپنی شدید است. برای تأثیر افزایش زمان بر بهبود حساسیت، می‌توانید شیوه شمارش گاماكانتر را مثال بزنید. می‌دانید كه دستگاه مذكور می‌تواند میزان پرتودهی لوله آزمایش را به دو صورت شمارش تجمعی یا شمارش در واحد زمان محاسبه كند كه در این میان روش CPM یا شمارش در دقیقه (Count Per Minute) رایج تر است، یعنی دستگاه را روی واحد زمانی خاصی (مثلاً روی 12 ثانیه) تنظیم می‌كنند و هر مقدار انرژی كه توسط دتكتور جذب شد، به طور اتوماتیك در عدد 5 ضرب می‌‌شود تا شمارش در 60 ثانیه به دست آید. حال اگر احتمال دهیم به دلیل كم بودن مقدار یك آنتی‌ژن یا هر ماده مورد جستجو در سرم بیمار، قدرت رادیواكتیویتی لوله آزمایش كم است، می‌توان دستگاه را طوری تنظیم كرد كه شمارش آن بیمار را در زمان طولانی‌تری انجام دهد تا رادیواكتیویتی قابل قبول‌تر و تكرارپذیرتری به دست آید كه از شمارش بلانك یا NSB كاملاً متمایز باشد.

– این نكته كاربردی خوبی برای دانستن محدوده حساسیت و ویژگی بود. الان بود كه می‌‌خواستم در مورد كاربردهای افزایش حساسیت و ویژگی سؤال كنم.

– شما همچنین می‌توانید به جای معیار ”زمان” از معیار “میزان شمارش” استفاده كنید، یعنی به دستگاه دستور دهید كه معیار شمارش پرتودهی را روی 50/000 یا صد هزار تنظیم كند و آنقدر لوله را جلوی دتكتور خود نگه دارد تا به شمارش مورد نظر برسد. در این حالت ”زمان سپری شده” توسط دستگاه اعلام می‌‌شود. به عبارت دیگر گزارش نتیجه بیماران و استانداردهای شما برحسب ثانیه خواهد بود، یعنی زمان می‌تواند طبق اصل ”تلحیم ”sensitivity  را تحت تأثیر قرار دهد و هر چه مقدار ماده مورد جستجو كمتر باشد، زمان بیشتری را باید منتظر بمانید.

– از توضیحات شما متشكریم.

– نكته دیگری به خاطرم رسید. در همان كتاب گرادوول، تصویری وجود دارد كه من در جای دیگری ندیده‌ام و نشان می‌دهد تراكم اجزاء سلولی در گلبول‌های قرمز آلوده به انگل مالاریا كمتر می‌شود و لذا جرم حجمی آنها كاهش می‌یابد، به صورتی كه پس از سانتریفوژ كردن در منطقه زیر بافی‌كوت واقع می‌شوند. این پدیده را خود من چند بار با لوله هماتوكریت تجربه كرده‌ام كه بعد از شكستن لوله و تهیه فروتی از آن قسمت، می‌توان تعداد بیشتری عناصر انگلی را دید. اگر گفتید كه در این تكنیك با استفاده از كدام اصل، حساسیت را بالا می‌بریم؟

– با اصل تلحیم. نه! نه! تغلیظ.

– مرحبا. آفرین بر حواس جمع.

اتفاقاً چندین سال پیش هم یك شركت خارجی روش ساده‌ای برای تشخیص مالاریا عرضه كرده بود كه با استفاده از لوله‌های هماتوكریت آغشته به آكریدین اورانژ و دارای درپوش (كه به عوض خمیر هماتوكریت به یك سر آن نصب می‌شد)، می‌توانستیم در مدت زمان كوتاهی با استفاده از میكروسكپ فلوئورسانس این تست را انجام دهیم و حداقل یك روش اسكرین یا غربالگری جالب توجه بود، ولی به دلیل گرانی و همچنین به دلیل نیاز به تجهیزاتی بیش از آنچه كه در آزمایشگاه‌های محیطی كشور موجود است، رونق پیدا نكرد. در آن روش هم براساس همین اصل تغلیظ یا Concentration موجب ارتقاء حساسیت می‌شوند.

البته همان سال‌ها در ایران، شركت واردكننده آن روش، به طور همزمان، سیستم خاصی را تحت عنوان epi–fluorescent ارائه می‌كرد كه نیاز آزمایشگاه‌ها به میكروسكپ‌های گران‌قیمت فلوئورسنت را رفع می‌كرد. آن سیستم جالب شامل یك منبع تغذیه با مولد نور UV بود به همراه عدسی شیئی ویژه‌ای كه به جای عدسی 40 میكروسكپ شما نصب می‌شد و می‌توانست نور تهییج‌كننده را از طریق فیبر نوری به لام میكروسكپ (یا در اینجا به لوله هماتوكریت) بتاباند و متعاقباً هم نور Visible نارنجی را به عدسی چشمی برساند.

می‌دانید چرا این مثال را زدم؟ … مسئله دیگری كه به بحث ما مربوط می‌شود این است كه یكی دیگر از راه‌های افزایش حساسیت در آزمایشگاه، ساده كردن تكنیك‌ها و بی‌نیاز كردن تست از نیروی تخصص‌یافته و ماهر است. بدیهی است در این روش ساده تشخیص مالاریا به كمك میكروسكپ فلوئورسنت، نیاز به نیروی با تجربه بالا وجود ندارد و چنانچه نتیجه تست یك بیمار در بررسی اولیه مثبت شود، آنگاه توسط فرد با تجربه‌ای، یك لام رنگ‌آمیزی شده از همان خون مورد بررسی قرار می‌گیرد كه این بررسی دوم، تستی است با ویژگی بالاتر و نزدیك به صد درصد. یك قانون مهم در آزمایشگاه این است كه اصولاً چیزی كه با وضوح كامل و بدون هر گونه ابهام با چشم میكروسكوپیست ورزیده‌ای دیده می‌شود، دارای ویژگی نزدیك صد در صد است مثل دیدن جسم لیشمن. در گوشه‌ای دیگر از آزمایشگاه یعنی در بخش باكتریولوژی نیز اگر نتیجه تست‌های گالری و كشت یك باكتری در حد جنس و گونه انجام شود، آن هم دارای ویژگی خیلی بالا و نزدیك به صد در صد است. از همین روست كه می‌گوئیم لام اسید فاست برای سل در مقایسه با كشت TB فاقد ویژگی است و تست‌های نواری یا سرولوژی تشخیص مالاریا در مقایسه با میكروسكوپی مالاریا فاقد ویژگی هستند. در آزمایشگاه تشخیص طبی، به Experienced eye و Experienced hand بهای زیادی داده می‌شود؛ یعنی باید بهای زیادی داده شود. آزمایشگر نباید مقهور دستگاه و تكنولوژی شود، بلكه باید آن را كاملاً در چنبره خود داشته باشد و به قول معروف، سوار بر اسب كار باشد تا با آگاهی كامل بتواند پروسه آزمایش را در دست بگیرد و همه این مسائل علمی و تئوریك را كه عرض می‌كنم عملاً در صحنه آزمایش به كار ببرد و اصطلاحاً پیچ وولوم آزمایش را عنداللزوم كم و زیاد كند با آگاهی و بصیرت و معرفت كامل نسبت به آنچه كه زیر دستش و زیر نگاهش انجام می‌گیرد. متأسفانه روزبه‌روز خودمان را بیشتر و بیشتر به دستگاه‌ها سپرده‌ایم و به شكل محض و دربست در اختیار تكنولوژی‌ها قرار گرفته‌ایم و عینك‌های تیره‌تر و تیره‌تری جلوی چشممان می‌گذاریم و عملاً احساس می‌كنم هر سال لایه‌های ضخیم‌تری دارد جلوی دید ما آزمایشگاهیان را می‌گیرد.

– آقای دكتر محمدی؛ اشاره كردید كه الكتروفورز روی ژل در مقایسه با الكتروفورز استات سلولز از حساسیت بیشتری برخوردار است. چرا روش روی ژل در آزمایشگاه‌ها كمتر مورد استفاده است؟ گمان نمی‌كنم در دانشگاه‌ها هم روش الكتروفورز ژل را در دوره كاردانی و كارشناسی آموزش بدهند.

– اگر اجازه بدهید مبحث را در همین جا ختم كنیم و دیگر وارد موضوع جدیدی نشویم تا ان‌شاء‌ا… در اولین فرصت چند مطلب مهم كه حین بحث یادداشت كردم، راجع به تأثیر تجربه تكنسین و چشم او یا اساساً تأثیر مشاهده‌گر بر ثمربخشی و Utility تست‌های آزمایشگاهی و كوتاهی ما در استفاده مناسب از این توانایی‌ها برایتان بگویم.

– از شما متشكریم و از این كه وقت خودتان را در اختیار ما گذاشتید، سپاسگزاریم.

– مهمترین دلیل آن، سادگی كار با تكنیك استات سلولز است. ژل‌های آماده، ساخت خارج از كشورند و گران هستند. نگهداری ژل نیاز به یخچال دارد و باید در لفافه نگهداری شوند تا تبخیر نشوند در حالی كه عمر كاغذهای استات سلولز خیلی زیادتر است درست مثل خود كاغذ؛ و البته شما می‌دانید كه الكتروفورزهای قدیم را بر روی كاغذ معمولی انجام می‌داده‌اند و همین الكتروفورز، نسل جدیدتر كروماتوگرافی محسوب می‌شود!

چون چند دقیقه قبل بطور مفصل صحبت از ”نسل” به میان آمد (منظور مبحث قبلی در نشریه شماره 61 می‌باشد) این را هم اضافه كنم كه كاغذ استات سلولز نسل تكامل یافته كاغذ معمولی است كه پلیمرهای بسیار منظم‌تری دارد و ناخالصی‌های آلی و معدنی آن را گرفته‌اند. به همین دلیل لكه‌های حاصل روی استات سلولز، شارپ هستند و حاشیه منظم‌تری در مقایسه با لكه‌های روی ژل دارند. مشابه این خلوص را در مورد آگاروز و آگار هم داریم كه قیمت ژل آگاروز را چند برابر ژل آگار می‌كند.

البته در پاسخ به سؤال شما در مورد حساسیت الكتروفورز روی ژل عرض كنم كه تأكید قبلی مرا فراموش نكنید كه در انجام یك آزمایش باید ببینید چه مقدار از حساسیت یا ویژگی را نیاز دارید. به تبلیغ شركت‌های فروشنده كیت و تجهیزات نگاه نكنید كه چه ادعایی می‌كنند. شما باید ببینید كه آیا به آن چه ادعا می‌شود نیازمندید یا نه. ضرب‌المثل معروفی می‌گوید وقتی به بازار می‌روی، گوشهایت را در خانه بگذار و چشمهایت را با خود ببر. وانگهی، مگر فكر می‌كنید از همین الكتروفورز استات سلولز در آزمایشگاه‌های ما به‌درستی استفاده می‌شود كه قرار باشد سراغ الكتروفورز‌های حساس‌تر برویم؟ چنانچه قرار باشد الكتروفورز روی ژل انجام دهیم، آن وقت دیگر كم‌كوشی پذیرفته نیست و نمی‌توان با دستگاه‌های اسكنر كامپیوتری، جواب خوب از الكتروفورز گرفت؛ حتماً نیاز به اسكنرهای دانسیتومتریك است و باید سهل‌طلبی را كنار گذاشت.

اگر اجازه بدهید چند دقیقه تنفس كنیم و قدم كوتاهی بزنیم تا مطلب مهمی راجع به تأثیر تجربه آزمایشگر و چشم او یا اساساً تأثیر مشاهده‌گر بر حساسیت الكتروفورز و كوتاهی ما در استفاده مناسب از این تكنیك برایتان بگویم.

قرار شد قبل از هر چیز ببینید كه آیا در آزمایشی كه انجام دهید به حساسیت بالا نیازی دارید یا نه.

البته همینجا این موضوع را بگویم كه همواره برای افزایش حساسیت زیاد كردن حجم نمونه و پرمایه كردن آن یا بهتر بگویم همیشه باعث افزایش حساسیت نمی‌شود، بلكه مواردی هست كه باید از حجم نمونه كم كرد.

مثلاً در تست G6PD افرادی را دیده‌ام كه تست آنها طبیعی است، ولی در صحبت معلوم می‌شود كه مبتلا به فاویسم هستند. مسلماً میزان نقص آنزیمی این افراد زیاد نیست، اما برای آن كه آبروی آزمایشگاه حفظ شود و این تباین و تنافر بین وضعیت بالینی و نتیجه آزمایشگاه به وجود نیاید.