بوردتلا
این باكتری همانند بوردتلا پاراپرتوسیس و برخلاف سایر بوردتلاها غیرمتحرك بوده و در كشت‌های اولیه نیاز به فاكتورهای X و V دارد و در محیط‌های خوندار ایجاد همولیز می‌كند. برخلاف سایر گونه‌ها، بوردتلا پرتوسیس فعالیت اوره‌آزی نداشته و روی محیط شکلات آگار و سیترات رشد نمی‌کند. تولید سم پرتوسیس (Pertussis Toxin) بوسیله بوردتلا پرتوسیس، مهمترین اختلاف بوردتلا پرتوسیس با سایر گونه‌ها است. این سم مسئول بسیاری از علائم و یافته‌های پاتولوژیك مرتبط با سیاه‌سرفه می‌باشد. بوردتلا پرتوسیس در دمای 28 درجه سلسیوس و در حضور سولفات منیزیم یا اسید نیکوتینیک در محیط كشت، تغییرات فنوتیپی قابل‌برگشتی پیدا می‌کند و قدرت بیماریزایی آن كاهش می‌یابد. ایزوله های اولیه بوردتلا پرتوسیس بسیار بیماریزا و تولید‌كننده توكسین می‌باشند، اما ساب‌کالچرهای بعدی منجر به ایجاد و ظهور تیپ‌های جدید كلنی می‌گردد كه از نظر میزان بیماریزائی متفاوتند. این تغییرات در بیماریزائی، ناشی از تغییرات فاز می‌باشد. بطور کلی بوردتلا پرتوسیس دارای 4 تیپ كلنی یا فاز می‌باشد. ایزوله‌های فازI (ایزوله های تازه) دارای کپسول، پیلی، سمی و بیماریزا می‌باشند. ساب‌کالچرهای بعدی دارای فازهای III, II ,IV می‌باشند که به تدریج خصوصیات بیماریزائی خود را از دست می‌دهند. فازIV بدون كپسول و پیلی و غیربیماریزا می‌باشد.
بوردتلا پرتوسیس در حلق، بینی و خلط بیماران و در حیوانات یافت می‌شود و از طریق تنفسی میزبان انسانی خود را آلوده می‌کند. این باکتری دارای هیچ ناقلی نیست و به خون همانند ویبریوکلرا تهاجم ندارد و سبب سپتی‌سمی یا باکتریمی نمی‌گردد. در افراد غیرواکسینه که با بوردتلا پرتوسیس مواجه می‌شوند، میزان بروز بیماری 90 تا 95 درصد گزارش شده است. تلاش‌های وسیع برای یافتن افراد ناقل بوردتلا پرتوسیس کاری بی‌فایده می‌باشد. نتیجه مطالعه روی افراد غیرواکسینه در دانمارک نشان داد که 61 درصد افراد در دوران کودکی خود، سیاه‌سرفه را تجربه کردند، بطوریکه همه افراد در بررسی ایمنولوژیک، ابتلاء قبلی به بوردتلا پرتوسیس را نشان می‌دادند. این مطالعه این حدس را قوی کرد که اگرچه بوردتلا پرتوسیس ناقل بدون علامت ندارد، ولی در بعضی از افراد، سبب بیماری تنفسی شده که به عنوان سیاه‌سرفه شناسائی نمی‌گردد.
بطور كلی بیماری سیاه‌سرفه دارای سه مرحله می‌باشد:
1- مرحله نزله‌ای یا کاتارال مرحله اولیه بیماری سیاه سرفه می‌باشد. 10 روز بعد از تماس با بوردتلا پرتوسیس علائم اولیة بیماری شامل عطسه فراوان، آبریزش بینی، سرفه شبانه، تب و كونژنكتیویت در فرد بیمار ظاهر می‌شود. همانند ویروس سرخک و تعدادی پاتوژن‌های دیگر دستگاه تنفسی، بوردتلا پرتوسیس در مرحله اولیه بیماری به شدت مسری می‌باشد.
2 – یك یا دو هفته بعد از مرحله اولیه، مرحله حمله‌ای (پاروکسیمال) سیاه‌سرفه آغاز می‌گردد. در طی هر مرحله حمله‌ای سرفه (که حداقل 30 ثانیه یا بیشتر طول می‌کشد) بیمار دچار 20-5 دقیقه سرفه بدون مكث همراه با خروج ترشحات چركی زیادی از بینی و دهان می‌شود. در انتهای هرحمله، فرد بیمار دچار آنوکسی و كبودی می‌گردد. سپس هوا با سرعت به شش‌های خالی از هوا بر می‌گردد و صدای خروس یا خس‌خس را سبب می‌شود. از دیگر علائم بیماری در مرحله حمله ای، استفراغ، خونریزی از بینی(Epistaxis)، ادم در ناحیه پری‌اربیتال و کونژنکتیویت هموراژیك می‌باشد. تب فقط در صورت ابتلای ثانویه به سایر باكتریها مثل استرپتوکوک گروه A ایجاد می‌گردد. لنفوسیتوز لنفوسیتیک در 25 درصد از بیماران با سن زیر شش ماه و 75 درصد در بیماران با سن بالای شش ماه مشاهده می‌شود.کل این دوره 4-2 هفته طول می‌كشد، اما در بعضی از بیماران این مرحله تا 6 هفته ادامه می‌یابد.
3- سیاه‌سرفه عموماً در طی مرحله نقاهت (Convalescent Stage) رفع می‌شود. این مرحله معمولاً 2 هفته طول می‌كشد (البته ممکن است که تا چند ماه طول بکشد) و بیمار در معرض ابتلا به پنومونی تهدید‌کننده حیات و دیگر عفونت‌های دستگاه تنفسی ایجاد شده توسط استرپتوکوک گروه A، پنوموكك و هموفیلوس آنفلونزا قرار داشته باشند. این حساسیت بالا به دلیل این می‌باشد که اپی‌تلیال مژه‌دار ناحیه دستگاه تنفسی بیمار به شدت آسیب دیده و ریه به این عفونت‌ها حساسیت بالا پیدا کرده است.
تشخیص آزمایشگاهی
تشخیص سیاه‌سرفه در روزهای اول بیماری اغلب مشکل است و با گریپ و برونشیت اشتباه می‌شود، ولی در هفته سوم و چهارم چون علائم ظاهر شده‌اند تشخیص بسیار ساده می‌باشد. در تشخیص آزمایشگاهی بیشتر از کشت و شمارش گلبولی و کمتر از روشهای دیگر استفاده می‌شود. آزمایشهای سرولوژی به علت اینکه قاطع نبوده و دیر مثبت می‌شوند کمتر مورد استفاده قرار می‌گیرند.
نمونه‌های ارسالی به آزمایشگاه
نمونه ترجیحی، مایع حامل از شستشوی بینی با نمک می‌باشد. همچنین می‌توان ازسوآب نازوفارنکس یا قطرات حاصل از سرفه در داخل ظرف سرفه (که در هنگام سرفه در جلوی دهان بیمار قرار داده می‌شود) استفاده کرد، ولی این نمونه‌ها به خوبی نمونه حاصل از شستشوی بینی نیست. چون باکتری به پنبه و کلسیم آلژینات حساس می‌باشد باید سواب جهت نمونه‌گیری از داکرون و ریون (الیاف مصنوعی) باشد. (به خصوص اگر بخواهیم با روش مولکولی مانند PCR بوردتلا پرتوسیس را ایزوله کنیم نباید از سواب‌های از جنس پنبه و کلسیم آلژینات و از جنس فلزات به خصوص آلومینیوم استفاده کرد) سواب را باید تا دیواره خلفی گلو وارد کرد و چند لحظه در آنجا نگه داشت تا با ترشحات آغشته گردد. سپس سواب را بایستی در محیط‌های انتخابی بوردتلا تلقیح نمود. هم چنین می‌توان از تکنیک Cauph plate برای نمونه‌گیری استـــفاده کرد. در این طریقه پلیت حاوی محیط کشت بوردت-ژانکو دارای آنتی‌بیوتیك را در هنگام سرفه در فاصله 10 سانتی‌متری جلوی دهان بیمار نگاه داشته تا قطراتی از دهانش خارج شده و بر سطح آن قرار گیرد و سپس در گرمخانه قرار می‌دهند. هرچند که در این روش، فلور نرمال دهان بیمار سطح محیط کشت را می‌پوشاند و تشخیص را دچار مشکل می‌کند، ولی روشی بسیار مناسب برای نمونه‌گیری در افراد مبتلا به سیاه‌سرفه می‌باشد.
نکته: نمونه‌ها باید در طی 2-1 ساعت کشت داده شوند، در غیر این‌صورت از محیط‌هـای انتقالی مانند casamino acid broth با pH=7.2، ریگان-لو و چارگول میشلو آگار(Charcol Michli agar) بایستی استفاده کرد.
در آزمایشگاه پس از انتقال نمونه‌ها، برای تشخیص بوردتلا پرتوسیس از روشهای زیر استفاده می‌شود:
کشت
از محیط اختصاصی بوردت- ژانکو (آگار سیب‌زمینی، خون گوسفند، گلیسرول به اضافه متی‌سیلین (2.5μg/ml) یا سفالکسین(40 μg/ml) یا اگزاسیلین ((0.625 μg/ml، ریگان‌لو، اســـتانیر-اسکولیت آگار(Stanier-Scholte-Ager) (حاوی سیکلوسرین و سفالکسین) و محیط BCYE (آگار عصــــــــاره مخمر- چارگول بافری شده) که برای لژیونلا پنوموفیلا مورد استفاده قرار می‌گیرد، استفاده می‌شود. ظروف باید در دمای 35 تا 37 سلسیوس به مدت 3 تا 12 روز (در 4-2 روز قابل جداسازی می‌باشد) در حضور7-5 درصد CO2 و در محیط‌های مرطوب (مانند یک کیسه پلاستیکی دربسته) نگهداری شوند. پس از آن با مشاهده پلیت‌ها زیر میکروسکوپ (با عدسی× 10)، کلنی‌های به بزرگی 1تا 2 میلی‌متر، گرد، گنبدی شکل، صاف براق و خاکستری رنگ و شبیه قطره جیوه یا دانه مروارید ظاهر می‌شود که وقتی تمام سطح محیط کشت را بپوشاند، پوشش چسبنده، خاکستری رنگی شبیه رنگ آلومینیوم بوجود می‌آید. این باکتری تولید همولیز می‌کند و پس از چند بار کشت روی محیط‌های ساده قدرت رشد پیدا می‌کند.
پس از مشاهده کلنی ارگانیسم‌ها به‌وسیله رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس یا بوسیله آگلوتیناسیون روی لام در اثر آنتی‌سرم‌های اختصاصی تشخیص داده می‌شود.
رشد بوردتلا پرتوسیس روی محیط ریگان-لو
(( نکات مهم ))
– افراد بیمار از نظر آنتی‌بادی علیه پرتوسیس بررسی نمی‌گردند، زیرا تا دوره نقاهت، آنتی‌بادی قابل جداسازی ظاهر نمی‌شود.
– كشت خون نیز مفید نمی‌باشد، زیرا این باكتری وارد خون نشده و فاز باكتریمی ندارد.
– کشت در هفته اول بیماری 90% و در هفته سوم در 50% بیماران مثبت می‌شود.
– بوردتلا پرتوسیس برخلاف سایر گونه‌های بوردتلا برروی مکانگی آگار، بلاد آگار و شكلات آگار رشد نمی‌کند.
رنگ‌آمیزی گرم
اگر در رنگ‌آمیزی گرم از سافرانین به مدت 2 دقیقه، یا از فوشین بازی آبی 0/2% استفاده گردد، مشاهده کوکوباسیل‌های گرم منفی به صورت تکی یا جفت افزایش می‌یابد.
شکل 2: اسمیر گرم بوردتلا پرتوسیس
شمارش گلبولی
در بیماری سیاه‌سرفه، افزایش گلبول سفید شدید، از 20.000 تا 30.000 به همراه لنفوسیتوز 70 تا 90 درصد وجود دارد که این افزایش ناشی از اثر محرک بر آنها می‌باشد.
آزمایش ایمونوفلورسانس
برای شناسایی قطعی ارگانیسم از آگلوتیناسیون با آنتی‌بادی‌های سرمی اختصاصی یا آنتی‌بادی‌های نشان‌دار با مواد فلوئورسنت استفاده می‌شود. از تست ایمونوفلورسانس مستقیم آنتــــــــــی‌بادی( Direct fluorescent antibody DFA) برای ارزیابی بوردتلا پرتوسیس در نمونه استفاده می‌شود. این تست اگرچه سریع می‌باشد، ولی کشت، حساسیت بیشتری نسبت به آن دارد. برای مثال گروهی گزارش کردند که تست ایمونوفلورسانس آنتی‌بادی تنها در 6 نمونه از 20 نمونه بیمارانی که کشت آنها مثبت شده بود، مثبت گردید. بنابراین تا حساسیت این تست اصلاح نشود، نمی‌توان آن را برای کارهای روتین توصیه کرد.
شکل3: تست DFA جهت شناسائی بوردتلا پرتوسیس
تکنیک‌های جدید شناسائی بوردتلاها
از منوکلونال آنتی‌بادی ضد LPS و FHA در روشهای Dot- blot و ELISA استفاده می‌گردد. همچنین از روشهای مولکولی مانند PCR جهت شناسایی استفاده می‌شود.
آنتی‌بیوگرام
بدلیل اینکه تاکنون اریترومایسین داروی انتخابی بیماری سیاه‌سرفه باقی مانده و مقاومت کمی نسبت به آن گزارش شده، لذا نیازی به تعیین حساسیت به آنتی‌بیوتیک نمی‌باشد. در صورتی که نیاز به آنتی‌بیوگرام باشد، بایستی از محیط‌های مختلفی مانند مولر هینتون با 5% خون گوسفند، بوردت-ژانگو با 5 تا 20% خون اسب و ریگان-لو استفاده کرد. لازم بذکر است سویه‌های بوردتلا پرتوسیس در آزمایشگاه دارای MIC رنجی 0/02 تا 0/12 میکروگرم در میلی لیتر می‌باشد.
درمان
اریترومایسین درمان انتخابی افراد مبتلا به سیاه‌سرفه می‌باشد. درمان جایگزین، آمپی‌سیلین یا تری‌متوپریم-سولفومتاکسازول (TMP/SMX) می‌باشد.
