آزمایش‌های روزمره انعقادی و جنبه‌های کنترل کیفی

آزمایش‌های روزمره انعقادی و جنبه‌های کنترل کیفی

 دكتر حبيب‌‌الله گل‌افشان

آزمایش‌های روزمره انعقادی

برای ارزیابی و شناسایی علت خونریزی بایستی پروتئین‌های سیستم انعقاد، سیستم فیبرینولیتیک، شمارش پلاکت‌ها و عملکرد آنها مورد سنجش قرار گیرند.

سه آزمایش aPTT و PT و TT (زمان ترومبین) از آزمایش‌های روزمره انعقاد خون هستند.

در آزمایش PTT فعال‌ شده یا aPTT حجم‌های مساوی از محلول حاوی سطوح با شارژ منفی و فسفولیپیدی برای فعال کردن فاکتورهای تماسی به‌ ویژه 12 به همراه پلاسمای بیمار در 37 درجه انکوبه شده و بعد از 3 تا 5 دقیقه کلرور کلسیم mM30 به لوله آزمایش اضافه شده و زمان لازم برای تولید لخته فیبرینی اندازه‌گیری می‌شود. آزمایش PTT مسیر داخلی انعقاد را ارزیابی کرده و کمبود هر فاکتور انعقادی بجز 7 و 13 موجب طولانی شدن آزمایش می‌گردد.

مسیر داخلی انعقاد خــون یک پدیده آزمایشــگاهی اســت که بـا آزمایش aPTT) activated partial thromboplastin time) یا زمان نسبی (پارشیال) ترومبوپلاستین ارزیابی می‌شود. در این مسیر تمام فاکتورهای انعقادی به جز 7 و 13 شرکت دارند. مواد شارژدار منفی از قبیل کائولین، سلیت و الاژیک اسید قادر به خودفعال‌ سازی فاکتور 12 انعقاد می‌گردند.

برای آزمایش PT یا زمان پروترومبین معرف فاکتور بافتی و یون کلسیم به پلاسمای بیمار اضافه شده و زمان لازم جهت انعقاد پلاسما اندازه‌گیری می‌شود. آزمایش PT مسیر فیزیولوژیک انعقاد را بررسی نمی‌کند، بلکه فاکتور بافتی اضافه شده در لوله آزمایش فاکتور 7 را فعال کرده و با آن ایجاد کمپلکس (tissue factor/VIIa) می‌کند، این کمپلکس مستقیماً فاکتور 10 را فعال می‌کند. در مسیر آزمایش PT کارآیی فاکتورهای 1 و 2 و 5 و 7 و 10 مورد سنجش قرار می‌گیرند. گفتنی است که سه فاکتور 2 و 7 و 10 در گروه فاکتورهای وابسته به ویتامین K هستند.

مسیر خارجی انعقاد یک پدیده آزمایشگاهی است که با آزمایش PT ارزیابی می گردد. این مسیر وابسته به فاکتورهای وابسته به ویتامین K به‌ویژه فاکتور 7 می‌باشد.

در آزمایش های انعقادی نقطه پایان (end point) آزمایش تولید پلیمرهای فیبرینی می‌باشد. ترومبین با جدا کردن فیبرینوپپتیدهای A وB  از مولکول فیبرینوژن آن را به فیبرین تبدیل می‌کند.

آزمایش PT فاکتورهای انعقادی مسیر خارجی (10 و 7 و 5 و 2 و 1) را ارزیابی می‌کند و گفتنی است که سه فاکتور از 4 فاکتور وابسته به ویتامین K یعنی 2 و 7 و 10 در این مسیر قرار دارند و از اینرو آزمایشی مناسب در پیگیری درمان با آنتاگونیست‌های ویتامین K مانند وارفارین است که به عنوان داروی ضد انعقاد کاربردی گسترده دارد.

فاکتورهای انعقادی 2 و7 و 9  و 10 و پروتئین‌های تنظیم‌گر انعقاد مانند پروتئین‌های Z ، S ، C برای کارآیی احتیاج به ویتامین K دارند. آنزیم کربوکسیلاز (Carboxylase ) کبدی با کوفاکتور احیاء شده ویتامین K موجب کربوکسیله کردن اسید آمینه‌های گلوتامیک در فاکتورهای فوق پس از ترجمه آنها می‌گردد.این فرآیند با تولید میدان Gla در فاکتورهای فوق امکان ارتباط با کلسیم و فسفولیپیدهای با شارژ منفی که برای پروسه انعقاد اساسی است را فراهم می‌آورد. ویتامین K احیا شده در فرآیند کربوکسیله شدن گلوتامیک اسید به فرم اکسید شده یا اپوکسید در‌می‌آید که توسط آنزیم ردوکتاز کبدی دوباره به فرم احیاء شده درآمده و وارد چرخه می‌شود. وارفارین با جلوگیری از چرخه احیاء ویتامین K از تولید میدان Gla و در نتیجه از کارآیی فاکتورهای 2 و7 و 9  و 10 جلوگیری می‌کند.

واحد (international normalized ratio (INR یا نسبت همسو شده بین‌المللی، یکی از شیوه‌های گزارش آزمایش PT بر مبنای معرف فاکتور بافتی استاندارد شده یا همسو شده با معرف بافتی مرجع WHO می‌باشد. به بیان دیگر اگر آزمایش PT بیمار با معرف بافتی مرجع انجام شود، نسبت PT بیمار به کنترل برابر INR می‌گردد.

(international sensitivity index (ISI یا نشانگان حساسیت بین‌المللی، حساسیت معرف PT به کمبود فاکتورهای وابسته به ویتامین K در مسیر خارجی را نشان می‌دهد و مقدار آن از عدد یک تا 3 متغیر است. هر چه مقدار عددی ISI به یک نزدیک شود، بیانگر معرف بسیار حساس و چنانچه به عدد 3 نزدیک شود، بیانگر کاهش حساسیت آن است.

عصاره مغز و جفت و ریه سرشار از فاکتور بافتی است و هنگامی که معرف فاکتور بافتی از یک شرکت سازنده ضریب ISI را از WHO دریافت دارد، به مفهوم معادل‌سازی یا همسوسازی آن با معرف بافتی تولید شده از سوی WHO است.

معرف مرجع WHO از مغز انسان تهیه شده است و دارای ISI=1 می‌باشد.

برای محاسبه INR از رابطه زیر استفاده می‌شود:

                            Patient PT (sec)

(   ———————  )  ISI =  INR       
                              (sec)MN PT

مثال: چنانچه PT پلاسمای کنترل و بیماری با معرف بافتی (ترومبوپلاستین) یک شرکت سازنده که از مغز خرگوش تهیه شده، به ترتیب 12 و 24 ثانیه و دارای ISI=2 باشد.

INR= 4

بدین مفهوم که اگر آزمایش PT بیمار با معرف مرجع WHO انجام می‌شد، نسبت آزمایش بیمار به پلاسمای کنترل عدد 4 بود.

هر چه ISI به عدد یک نزدیک شود، آزمایش PT در کمبود فاکتورهای وابسته به ویتامین K به سرعت طولانی می‌گردد و هرچه به عدد 3 نزدیک شود به کندی طولانی می‌گردد، ولی محاسبه INR آزمایش PT را غیروابسته به معرف بافتی کرده و مثل این است که در هر جای دنیا که از واحد INR استفاده می‌شود، از یک نوع معرف شبیه فاکتور بافتی تولید شده از سوی WHO استفاده می‌کنند.

برای سهولت درک مطلب به مثال زیر توجه کنید:

آزمایش PT بیماری که وارفارین مصرف می‌کند در یک آزمایشگاه با معرف بافتی با 2/3=ISI برابر 22 ثانیه با کنترل 13 ثانیه و آزمایش PT همان نمونه در آزمایشگاه دیگر با معرف بافتی با 1/3=ISI برابر 30 ثانیه با کنترل 12 ثانیه شده است.

با توجه به اینکه ISI آزمایشگاه دوم نزدیک به عدد یک و بسیار حساس است، از این رو آزمایش PT به سرعت طولانی شده و عدد بالاتری در کمبود فاکتورهای وابسته به ویتامین K نشان داده است، ولی مقدار ISI در آزمایشگاه اول نزدیک به عدد 3 بوده که بیانگر کاهش حساسیت معرف بوده و از اینرو زمان آزمایش PT کمتر طولانی شده است، ولی توجه داشته باشید که مقدار ISI جواب هر دو آزمایشگاه را همسو کرده و حساسیت زیاد و یا حساسیت کم معرف‌ها را جبران کرده است و از اینرو هر دو مورد دارای INR یکسان هستند.

نکات مهم آزمایشگاهی برای آزمایش‌های انعقادی

•  ضد انعقاد مناسب برای آزمایش‌های انعقادی (PT و PTT و …) سیترات سدیم 105 تا 109 میلی‌مول در لیتر است که برای این منظور 13/3 یا 2/3 گرم Na3C6H5O7.2H2O را در 100 سی‌سی آب مقطر حل کرده و در یخچال نگه‌داری می‌شود.
• برای آزمایش‌های انعقادی مانند PT و PTT به 9 حجم خون یک حجم سیترات سدیم اضافه می‌شود. حداکثر تا یک دقیقه پس از خونگیری بایستی نمونه خون را با سیترات سدیم با واژگون‌ کردن (inversion) لوله آزمایش مخلوط کرد. برای مثال برای تهیه 2 سی‌سی خون مقدار 0/2 سیترات با 1/8 سی‌سی خون به حجم 2 سی‌سی رسانیده می‌شود.
• چنانچه هماتوکریت بیماری بیشتر از 55% باشد، بایستی مقدار سیترات با توجه به هماتوکریت تنظیم گردد. در غیر این صورت سیترات اضافی در حجم کم پلاسمای بیمار پرخون‌، با پیوند به کلسیم اضافه شده در هنگام آزمایش موجب طولانی شدن کاذب آزمایش می‌شود.
•  برای محاسبه سیترات لازم در هماتوکریت‌های بالا می‌توان از رابطه‌های زیر استفاده کرد.

 V × (PCV-100) (3 – 10 ×1/85)=  حجم سیترات موردنیاز به ازای هر سی‌سی خون

در رابطه‌های فوق PCV (هماتوکریت) و V برابر حجم خون موردنیاز است.

برای مثال: چه حجم از سیترات سدیم برای تهیه 2 سی سی خون جهت PT وPTT بیماری با هماتوکریت 60% لازم است؟

مقدار 0.07 سی‌سی از سیترات سدیم برای یک سی‌سی خون می‌باشد و از این رو برای تهیه 2 سی‌سی مقدار آن در عدد 2 ضرب می‌شود. بدین مفهوم که 0/14 سی‌سی سیترات سدیم در لوله ریخته و با خون به حجم 2 سی سی رسانیده می‌شود. برای محاسبه حجم سیترات برای 2 سی‌سی خون با هماتوکریت 60% می‌توان از رابطه دوم نیز استفاده کرد:

                      (  CC 0/14 = 2 × (60-100) (3 – 10 ×1/85= حجم سیترات موردنیاز

برای هماتوکریت‌های کمتر از 50% می‌توان به طور روزمره 0/2 سی‌سی سیترات سدیم را با 1/8 سی‌سی خون مخلوط کرد، ولی برای هماتوکریت‌های بالا حتماً نیاز به محاسبه مقدار ضد انعقاد می‌باشد.

• چنانچه با سیستم لوله‌های خلأدار از طریق یک سوزن وریدی نمونه‌های مختلف برای آزمایش‌های گوناگون تهیه می‌شود، نمونه مربوط به آزمایش‌های انعقادی بایستی اول گرفته شود، زیرا آلودگی سوزن نمونه‌گیری با محتویات لوله‌های دیگر مانند EDTA و یا ژل فعال‌کننده لخته در آزمایش‌های انعقادی تداخل ایجاد می‌کنند.

نمونه گیری با استفاده از سیستم‌های خلأدار

• برای آزمایش‌های انعقادی از تهیه نمونه خون از مسیرهای آغشته به هپارین (مانند کاتترهای وریدی) و از مسیرهای تزریق محلول‌های وریدی خودداری کنید. در موارد اضطراری بایستی مسیر وریدی را با 5 سی سی سالین شستشو داد و سپس 5 سی‌سی اول را دور ریخت و از آن پس اقدام به جمع‌آوری نمونه خون کرد.
• وجود هر گونه لخته، همولیز قابل رؤیت و نمونه با حجم کمتر از مقدار لازم، آزمایش‌های انعقادی را فاقد اعتبار می‌کند.
• افزایش حجم نمونه تا 10% حجم واقعی می‌تواند مورد پذیرش قرار گیرد، بعنوان مثال برای 2 سی‌سی نمونه تا افزایش 0/2 سی‌سی نمونه (2/2) قابل قبول می‌باشد.
• آزمایش‌های انعقادی به‌ ویژه آزمایش شناسایی آنتی‌بادی‌های ضد فسفولیپیدی را بایستی با پلاسمای فاقد پلاکت (کمتر از 10,000 در میلی‌متر مکعب از پلاسما) انجام داد، ولی آزمایش‌های PT و PTT روی پلاسمای پلاکت‌دار هم بلامانع است و این به‌علت آن است که معرف‌های PT و PTT هم دارای مقدار اضافی از جایگزین فسفولیپید پلاکتی هستند. توجه داشته باشید که برای منجمد کردن پلاسما بایستی از پلاسمای فاقد پلاکت استفاده کرد.
• پلاسمای لیپیدی شیری رنگ (Lipemic) و پلاسمای زرد رنگ (ژاندیس) و پلاسمای قرمز (نمونه همولیز) ممکن است در دستگاه کوآگولومتر که نقطه پایان آزمایش بر مبنای نورسنجی (optic) قرائت می‌شود، ایجاد خطا کرده و از این‌رو انجام دستی آزمایش در موارد فوق سفارش می‌شود.
• فاصله زمان نمونه‌گیری تا انجام آزمایش‌های انعقادی وابسته به درجه حرارت نگهداری نمونه است. آزمایش PT با نگهداری نمونه خون در لوله سربسته در دمای 24 -18 درجه (نمونه سانتر‌يفوژ شده یا سانتریفوژ نشده) تا 24 ساعت از نمونه‌گیری بلامانع است.
• نگهداری پلاسما در 2 تا 4 درجه موجب فعال شدن فاکتور هفت در سرمـــــــــــــــــــــا (cold autoactivation) شده و زمان PT را 2 تا 3 ثانیه کوتاه می‌کند، از این‌رو بهتر است که اگر امکان انجام آزمایش PT تا 24 ساعت از نگهداری نمونه در حرارت اتاق نباشد، اقدام به منجمد کردن پلاسما کرد.
• آزمایش PTT نمونه‌های غیرهپارینه (سانتریفوژ شده یا نشده) در لوله سربسته در 2 تا 4 درجه یا 18 تا 24 درجه تا 4 ساعت از نمونه‌گیری بایستی انجام شود.
• نمونه‌های مربوط به بیمارانی که روی درمان هپارین می‌باشند (هپارین UFH) با نگهداری در دمای 2 تا 4 درجه یا 18 تا 24 درجه بایستی در یک ساعت سانتريفوژ و پلاسما جدا شود. آزمایش PTT تا 4 ساعت بر روی پلاسمای نگهداری شده در 2 تا 4 درجه بلامانع است.
• چنانچه بیماری همزمان روی درمان با ضد انعقادهای وارفارین و هپارین است و بیمار نیاز به آزمایش PT جهت پیدا کردن دُز درمانی با وارفارین دارد، بایستی از کیت‌های PT که دارای خنثی‌کننده هپارین هستند استفاده کرد. گفتنی است که هپارین به‌ویژه در مقدار زیاد می‌تواند PT را طولانی کند. از این‌رو برخی از کیت‌های PT دارای هپاریناز (heparinase) و یا دارای سلولز جهت برداشت هپارین از نمونه هستند. شرایط نگهداری نمونه در حالت فوق مانند نمونه هپارینه است.
• بایستی برای آزمایش‌های دیگر انعقادی که نمونه در دمای 2 تا 4 درجه یا 18 تا 24 درجه نگهداری می‌شوند، پلاسما را جدا کرده و ظرف 4 ساعت اقدام به انجام آزمایش کرد.
• چنانچه امکان انجام آزمایش در 24 ساعت برای PT و یا 4 ساعت برای PTT نباشد، پلاسما را جدا کرده و در 20- درجه برای دو هفته و یا در 70- درجه برای 6 ماه قرار دهید. پلاسمای منجمد شده را بایستی به سرعت در 37 درجه آب کرده و حداکثر تا 2 ساعت از نگهداری آن در 4 درجه اقدام به انجام آزمایش گردد.
• آزمایش‌های انعقادی به صورت دوبل انجام و میانگین نتایج گزارش می‌شود. چنانچه از رعایت استانداردهای تجهیزات اتوماتیک اطمینان دارید، آزمایش به صورت تکی نیز قابل قبول است.
• آزمایش PTT وابسته به تمام فاکتورهای مسیر داخلی (همه فاکتورها بجز 13 و 7) است و کاهش 15 تا 30 درصدی هر کدام از آنها موجب طولانی شدن آزمایش می گردد.

نکته بسیار مهم: افزایش بیش از حد یک فاکتور انعقادی ممکن است آزمایش PTT را در حضور کمبود فاکتورهای دیگر انعقادی نرمال کرده و بر کمبود آنها پوشش گذارد. حالت فوق در افزایش شدید فاکتور 8 ممکن است رخ دهد. گفتنی است که فاکتورهای 8 و فون ویلبراند و فیبرینوژن در گروه پروتئین‌های فاز حاد بوده و بیماری‌های التهابی منجر به افزایش سطح آنها می‌گردند.

نکته مهم: آزمایش PT و PTT در افزایش شدید فاکتورهای انعقادی ممکن است کمتر از زمان پلاسمای کنترل باشند.

نکته مهم: کمبود فاکتورهای تماسی مانند 12، پره کالیکرئین (فاکتور فلچر) و کینینوژن با وزن مولکولی زیاد (فاکتور فیتزجرالد) گرچه موجب طولانی شدن PTT می‌گردند، ولی بیمار در موارد فوق میلی به خونریزی نداشته و اعمال جراحی بدون هیچ نگرانی و بدون جایگزین کردن فاکتورها انجام می‌شود.

گفتنی است که آزمایش طولانی PTT به علت کمبود پره‌کالیکرین با تماس بیشتر پلاسما با شیشه (مثلاً 15 دقیقه انکوباسیون پلاسما بجای 2 تا 3 دقیقه استاندارد) نرمال می‌شود. به کارگیری محلول‌های فعال‌ کننده سطحی مانند اسیدالاژیک نیز موجب نرمال شدن PTT در کمبود پره‌کالیکرین می‌گردد. یادآوری می‌شود که در آزمایش PTT به پلاسمای بیمار فعال‌کننده‌های سطحی مانند کائولین یا سلیت (celite) یا الاژیک اسید به همراه یون کلسیم و جایگزین فسفولیپید پلاکتی به لوله آزمایش اضافه شده و زمان لخته شدن پلاسما مورد سنجش قرار می‌گیرد.

• افزایش زمان PTT همراه با آزمایش PT نرمال و بدون سابقه خونریزی ممکن است دال بر کمبود فاکتورهای تماسی مانند 12 و پره‌کالیکرئین و کینینوژن باشد. گفتنی است که بازدارنده لوپوس هم ممکن است با افزایش PTT و بدون خونریزی بلکه با ترومبوز همراه باشد.

نرمال بودن آزمایش‌های PTT و PT و همچنین شمارش پلاکت و کارآیی آن در بیمار مبتلا به خونریزی احتمال کمبود فاکتور 13 یا کمبود α2– آنتی پلاسمین یا اختلال در کمبود بازدارنده‌های فعال‌کننده پلاسمینوژن را مطرح می‌کند.

• کمبود فیبرینوژن بینmg% 80-100  موجب طولانی شدن تمام آزمایشات انعقادی که نقطه پایان آنها (end point) بر اساس تشکیل لخته است، می‌شود.
•  دمای انکوباتور برای آزمایش‌های انعقادی بایستی در محدوده 1 ± 37 درجه بوده و پلاسمای بیمار و کنترل هیچگاه قبل از انجام آزمایش‌های انعقادی بیشتر از 10 دقیقه در 37 درجه قرار نگیرد.
• حضور بازدارنده لوپوس ممکن است منجر به طولانی شدن PTT گردد، در این حالت طولانی بودن PTT با خونریزی همراه نبوده و بر عکس با خطر ایجاد ترومبوز همراه است.
• ترومبین با جدا کردن فیبرینوپپتیدهای A و B از مولکول فیبرینوژن آن را به فیبرین تبدیل می‌کند. جدا شدن فیبرینوپپتید A برای ایجاد لخته بسیار اساسی و اختلال آن موجب طولانی شدن PT و PTT و خونریزی می‌گردد، در حالی که اختلال در جدا کردن فیبرینوپپتید B گرچه آزمون‌های انعقادی را طولانی می‌کند ولی با خونریزی همراه نیست. فیبرینوپپتید B در بهم چسبیدن منومرهای فیبرین نقش دارد.

پرکاری سیستم فیرینولیتیک از قبیل کاهش 2α– آنتی‌پلاسمین و کاهش بازدارنده‌های فیبرینولیتیک موجب آب شدن سریع لخته توسط آنزیم پلاسمین می‌گردد. در این حالت، با وجود خونریزی در بیمار، آزمایش‌های PT و PTT طبیعی است.

نکته مهم: الگوی موجی‌شکل دو مرحله‌ای (biphasic transmittance waveform) در آزمایشات انعقادی به‌ ویژه آزمایش PTT مربوط به کمپلکس CRP با لیپوپروتئین‌های با دانسیته بسیار پایین (VLDL) بوده که در حضور کلسیم رسوب می‌کنند. الگوی دوفازی موجی شکل aPTT در عفونت‌های خونی، بیماران بدحال در بخش ICU و در بیماران مبتلا به انعقاد داخل عروقی منتشره مشاهده شده و ادعا گردیده که مارکر اولیه برای DIC می‌باشد.

در دستگاه‌های مبتنی بر سنجش تشکیل لخته (clot end point) زمان لخته شدن پلاسما به‌محض ایجاد تغییرات ناگهانی در عبور نور تابشی (transmittance) ثبت می‌گردد، ولی گاهی کمپلکس‌های VLDL-CRP قبل از ایجاد لخته نهایی با تشکیل رسوب ایجاد یک شیب اولیه در کاهش عبور نور تابشی (transmittance) کرده که به دنبال آن با تشکیل لخته نهایی یک شیب ناگهانی دیگر در کاهش عبور نور مشاهده شده که از آن پس منحنی عبورنور یکنواخت می‌گردد. به این حالت الگوی موجی شکل دو مرحله‌ای گویند.

منحنی آزمایش PTT در دستگاه کوآگولومتر روی محور مختصات که محور x بر حسب ثانیه و محور y بر اساس عبور نور (transmittance) درجه‌بندی شده است، ترسیم می‌گردد. گراف A آزمایش PTT تک‌ موج را نشان می‌دهد که زمان لخته با تغییر ناگهانی در کاهش نور تابشی همراه است. گراف B آزمایش دو فازی یا مواج PTT را نشان می‌دهد که موج اول کاهش عبور نور تابشی ناشی از رسوب CRP-VLDL و موج دوم به علت تولید لخته نهایی است.

آزمايش مخلوط پلاسماي بيمار با پلاسماي کنترل (Mixing study)

هنگامي که آزمايش PTT يا PT بيماري طولاني شود، براي شناسايي علت طولاني شدن اقدام به آزمايش مخلوط (mixing) مي‌گردد که در غالب موارد حجم‌هاي مساوي (mixing 1:1) از پلاسماي بيمار و کنترل را مخلوط کرده و اقدام به آزمايش مجدد تست طولاني شده مي‌گردد.

برای تهیه حوضچه پلاسمای کنترل(Control pool plasma ) دست‌ کم از 6 فرد سالم (زن و مرد) نمونه خون سیتراته گرفته و پلاسمای آنها مخلوط می‌گردد. توجه داشته باشید که حاملگی و یا بیماری‌های عفونی و التهابی موجب افزایش فاکتورهای فاز حاد انعقاد مانند فاکتورهای 8 و فیبرینوژن می‌گردند. سطح هر فاکتور انعقادی در حوضچه پلاسمای نرمال برابر 100% فرض می‌شود. سطح فاکتورهای انعقادی در افراد سالم جامعه ممکن است بین 50 تا 150 درصد نسبت به سطح فاکتورهای موجود در حوضچه پلاسمای کنترل باشد. پلاسمای کنترل در حجم‌های 0/5 سی‌سی در دمای 20- درجه برای 2 هفته و در 70- درجه برای 6 ماه قابل نگهداری می‌باشد.

تفسير آزمايش پلاسماي مخلوط در بیماری با PTT طولانی

1-   آزمايش PTT را روي مخلوط هم حجم از پلاسماي بيمار و کنترل به صورت فوري انجام دهيد. چنانچه PTT تصحيح شد (بدين مفهوم که برابر با PTT پلاسمای نرمال يا حداکثر 5 ثانيه بيشتر از نرمال) بيانگر کمبود فاکتورهاي انعقادي بوده و آزمايش سنجش فاکتورهاي انعقادي سفارش مي‌شود.

2-   چنانچه آزمايش PTT با پلاسماي مخلوط طولاني بود و تکرار آزمايش با افزايش فسفوليپيد اضافي نرمال شد، به بازدارنده لوپوس فکر کنيد. براي تهيه منبع فسفوليپيد در آزمايشگاه مي‌توان پلاکت‌هاي يک شخص را شستشو داد و سپس آنها را منجمد و آب کرد.

3–   چنانچه آزمايش فوري PTT روي پلاسماي مخلوط ابتدا تصحيح شود، ولي با انکوبه کردن مخلوط پلاسما به مدت 2 ساعت در 37 درجه طولاني گردد، بيانگر آنتي‌بادي عليه فاکتورهاي انعقادي به‌ويژه فاکتور 8 مي‌باشد.

توجه داشته باشيد که آنتي‌بادي عليه فاکتور 8 با گذشت زمان فاکتور 8 را خنثي مي‌کند و منجر به طولاني شدن PTT پلاسماي مخلوط مي‌گردد. در بازدارنده لوپوس و کمبود فاکتورهاي انعقادي آزمايش PTT پلاسماي مخلوط در زمان فوري و بعد از 2 ساعت طولاني مي‌ماند.

نکته مهم:

1-   از پلاسماي فاقد پلاکت (پلاسمايي که با سانتريفوژ تهيه شده و تعداد پلاکت‌ها در آن کمتر از 10,000 در ميلي‌متر مکعب است) براي شناسايي آنتي‌بادي‌هاي ضد فسفوليپيدي استفاده مي‌شود. لاشه‌ها و فسفوليپيدهاي پلاکتي قادر به خنثي کردن آنتی‌بادی‌های ضد فسفولیپیدی و در نتيجه منفي کاذب در آزمايش‌هاي شناسايي آنتی‌بادی‌های ضد فسفوليپيدی مي‌گردد.

اندازه‌گیری فیبرینوژن

فیبرینوژن را می‌توان بر پایه آزمایش‌های انعقادی مانند زمان ترومبین و زمان رپتیلاز اندازه‌گیری کرد. آنزیم ترومبین با جدا کردن فیبرینوپپتیدهای A و B از مولکول فیبرینوژن‌ آن‌ را به فیبرین تبدیل می‌کند، در حالیکه آنزیم رپتیلاز تنها با جدا کردن فیبرینوپپتید A از فیبرینوژن آن‌ را به فیبرین تبدیل می‌کند.

فیبرینوژن مولکولی متقارن است که از سه زوج زنجیره آلفا و بتا و گاما تشکیل شده است. فیبرینوپپتیدهای A وB در مرکز تقارن فیبرینوژن یا میدان E قرار دارند. پلیمری شدن منومرهای فیبرین شبکه پلیمری لخته را تولید می‌کند. جداشدن فیبرینوپپتید A برای ایجاد لخته و جلوگیری از خونریزی نقش مهمی دارد. درحالی‌ که فیبرینوپپتید B در پلیمری شدن بهتر منومرهای فیبرین شرکت می‌کنند.

زمان ترومبین (Thrombin Time ) و زمان رپتیلاز (Reptilase Time ) نسبت عکس با مقدار فیبرینوژن دارد. برای اندازه‌ گیری فیبرینوژن بایستی نخست گراف استاندارد را رسم کرد. گراف استاندارد ارتباط بین زمان ترومبین یا رپتیلاز با مقدار فیبرینوژن می‌باشد. بدین مفهوم که استاندارد فیبرینوژن در رقت‌های مختلف مورد آزمایش زمان ترومبین یا رپتیلاز قرار می‌گیرند، برای مثال اگر غلظت استاندارد فیبرینوژن mg%300 باشد و به طور قراردادی رقت 1:5 آن برابر mg%300 گرفته شود، رقت 1:10 آن معادل mg%150 و 1:20 آن معادل mg%75 خواهد بود. برای اندازه‌گیری فیبرینوژن، پلاسمای بیمار را 1:5 رقیق کرده و با محاسبه زمان ترومبین یا رپتیلاز، غلظت فیبرینوژن را از روی گراف تعیین می‌کنیم. دقت کنید که چنانچه پلاسما یا استاندارد رقیق نشوند، اشتباه یک ثانیه‌ای در خواندن زمان انعقاد تأثیر زیادی روی غلظت فیبرینوژن دارد، ولی با رقیق سازی و طولانی کردن زمان این حساسیت از بین می‌رود.

مقدار نرمال فیبرینوژن 350-150 میلی گرم درصد است. فیبرینوژن جزء گلوبولین‌های بتا است.

نکته‌های مهم در اندازه‌گیری فیبرینوژن

1-   هپارین درمانی یا آلوده شدن نمونه خون به هپارین موجب طولانی شدن زمان ترومبین و کاهش کاذب مقدار فیبرینوژن می‌گردد. هپارین آنزیم ترومبین را خنثی می‌کند و از این‌رو در مجاورت هپارین نمی‌توان از آزمایش زمان ترومبین برای اندازه‌گیری فیبرینوژن استفاده کرد. در این موارد می‌توان از زمان رپتیلاز استفاده کرد. آنزیم رپتیلاز توسط ترومبین خنثی نمی‌شود.

2-   غلظت زیاد اجزای پپتیدی فیبرین و فیبرینوژن (d-dimer, FDP) مانع پلیمری شدن فیبرین گردیده و از این‌رو با افزایش زمان انعقاد موجب کاهش کاذب فیبرینوژن می‌گردند. اجزای پپتیدی فیبرین و فیبرینوژن در انعقاد داخل عروقی منتشره افزایش می‌یابد.

3-   افزایش سطح پاراپروتئین‌ها در مایلوم مالتیپل با دخالت در پلیمری شدن فیبرین، زمان ترومبین و رپتیلاز را افزایش می‌دهند.

4-   در دیس‌فیبرینوژنمی (dysfibrinogenemia) سطح فیبرینوژن کارآمد که با آزمایش‌های انعقادی اندازه‌گیری می‌شود، کمتر از سطح آنتی‌ژنی اندازه‌گیری شده با روش‌های شیمیایی یا آزمایش‌های بر پایه واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی می‌باشد.

نکته: فیبرینوژن و فاکتور 8 و فاکتور فون ویلبراند جزء پروتئین‌های فاز حاد بوده و در بیماری‌های التهابی افزایش می‌یابد. از اندازه‌گیری فیبرینوژن برای پیگیری انعقاد داخل عروقی منتشره به‌ ویژه در جنین مرده نگهداری شده استفاده می‌شود. افت سریال فیبرینوژن در خانم حامله دارای پیش‌آگهی نامطلوب است.

گفتنی است که فیبرینوژن در حاملگی افزایش می‌یابد و از این‌رو میزان پایه در یک خانم حامله ممکن است 500 یا 800 میلی‌گرم باشد، بنابراين در تفسیر میزان فیبرینوژن در خانم حامله بایستی دقت کرد.

تزریق خون حجیم (Massive ) با کاهش فاکتورهای انعقادی به ویژه فیبرینوژن ممکن است موجب خونریزی شود. برای ثبات انعقادی بایستی حداقل سطح فیبرینوژن mg%100 باشد. تزریق هر کیسه کرایو به ازای هر 10 کیلوگرم % mg 50 ، فیبرینوژن را افزایش مي‌دهد.

داروی ال آسپارژیناز، والپورات سدیم و بیماری کبد و سندرم هیپرفیبرینولیز موجب کاهش فیبرینوژن می‌شوند.

کمبود فاکتور 13 و آزمایش تشخیصی آن

فاکتور 13 یا فاکتور پایدار کننده فیبرین عهده‌دار انسجام شبکه فیبرینی و جلوگیری از پاشیده شدن آن است. فاکتور 13 توسط آنزیم ترومبین، فعال و نقش ترانس‌ گلوتامیناز یا ترانس‌آمیداز دارد، بدین مفهوم که بین رشته‌های آلفا و گاما از مولکول‌های فیبرین ایجاد پیوند آمیدی(C=O-NH) بین اسید آمینه‌های گلوتامیک و لیزین می‌کند.

فاکتور 13 به صورت تترامر از دو واحد کاتالیز کننده (A) و دو واحد حامل (B) تشکیل یافته است. مقدار کمی از فاکتور 13 در پلاکت و منوسیت نیز وجود دارد.

فاکتور 13 نه تنها با اتصالات عرضی (cross link) لخته فیبرینی را محکم می‌کند، بلکه با ایجاد اتصالات با مواد زمینه‌ای در اطراف لخته در محکم چسباندن لخته به ناحیه آسیب عروقی نقش دارد. جالب اینکه فاکتور 13 با احتباس آنتی پلاسمین در لخته تازه تولید شده، آن را از هجوم پلاسمین در امان نگه می‌دارد.

فاکتور 13 فعال با ایجاد اتصالات عرضی شبکه فیبرینی را محکم می‌کند. در کمبود فاکتور 13 لخته‌‌ای که تازه تولید شده به سرعت از هم‌ پاشیده و بیمار میل به خونریزی پیدا می‌کند.

از مهمترین علایم کمبود فاکتور 13 ، خونریزی‌های تأخیری و سیکل‌های متعدد خونریزی است. خونریزی در بافت نرم به صورت کیست هموراژیک و تا 25% با شیوع خونریزی مغزی همراه است. سقط مکرر به علت نچسبیدن جفت به رحم و خونریزی از بندناف و تأخیر در ترمیم زخم به علت اختلال در رگ‌ سازی (angiogenesis) از علایم دیگر کمبود فاکتور 13 است.

خونریزی تأخیری به مفهوم آن است که بعد از یک حادثه خونریزی دهنده سیستم انعقاد با تشکیل فیبرین خون را بند می‌آورد، ولی چون شبکه فیبرینی بر اثر نبود فاکتور 13 از هم می‌پاشد، خونریزی دو‌مرتبه شروع شده و این چرخه خونریزی و بند آمدن تا درمان ادامه می‌یابد.

گفتنی است که غلظت 5% از فاکتور 13 برای عملکرد آن کافی بوده و علایم بالینی در کمبود یک تا 2 درصدی آن دیده می‌شود.

کاهش فاکتور 13 علاوه بر موارد ارثی در پورپورای هنوخ (henoch-schonlein) و بیماری التهابی روده مشاهده شده است. مصرف داروهایی مانند ایزونیازید و فنی‌توئین همراه با شکل‌ گیری بازدارنده علیه فاکتور 13 است.

نکته مهم: در کمبود فاکتور 13 تمام آزمایش‌های انعقادی که نقطه پایان آن‌ها بر اساس تولید لخته است از قبیل PT و PTT و… طبیعی است و این در حالی است که بیمار میل به خونریزی دارد. گفتنی است که نقطه پایان تست‌های فوق زمان انسجام لخته نیست، بلکه تولید شبکه پلیمری فیبرین می‌باشد.

آزمایش پایداری لخته در اوره 5 مولار

لخته ناپایدار به علت فقدان فاکتور 13 یا وجود بازدارنده علیه فاکتور 13 در محلول اوره 5 مولار یا یک درصد منوکلرواستیک اسید حل شده، در حالی که لخته پایدار شده در حضور فاکتور 13، حداقل به‌مدت 24 ساعت در محلول‌های فوق پایدار می‌ماند.

روش آزمایش

1-   سه لوله آزمایش 1 و 2 و 3 را نشانه‌گذاری کرده و در لوله اول 0/3 سی‌سی پلاسمای فاقد پلاکت بیمار و در لوله سوم 0/3 سی‌سی پلاسمای نرمال فاقد پلاکت اضافه کنید. به لوله دوم 0/2 سی‌سی پلاسمای بیمار و 0/1 سی‌سی پلاسمای نرمال اضافه کنید.

2-   به هر لوله 0/1 سی‌سی از محلول 0/025 مولار کلرور کلسیم اضافه کرده و لوله‌ها را به مدت 30 دقیقه در 37 درجه بگذارید تا لخته فیبرینی ایجاد گردد.

3-   به هر لوله 3 سی‌سی محلول اوره 5 مولار اضافه کرده و سر آن را پوشانده و با حرکت دادن لوله، لخته را جدا کرده تا در محلول اوره قرار گیرد.

4-   لوله‌ها را در حرارت اتاق برای مدت 24 ساعت نگهداری کرده و وضعیت لخته یا کدر شدن محلول در زمان‌های 1 و 2 و 4 و 24 ساعت مورد ارزیابی قرار می‌گیرد. کوچک شدن اندازه لخته، شکسته شدن لخته و کدر شدن محلول اوره علامت ناپایداری لخته است.

وضعیت لخته در لوله شماره یک با وضعیت لخته نرمال در لوله شماره 3 مقایسه می‌شود. متلاشی شدن لخته در لوله اول و پایداری لخته در لوله‌های دوم و سوم، علامت کمبود فاکتور 13 می‌باشد. چنانچه بیمار دارای بازدارنده علیه فاکتور 13 باشد، پاشیدگی لخته در لوله‌های 1 و 2 مشاهده می شود در حالی که لخته در لوله سوم حداقل بمدت 24 ساعت پایدار می‌ماند.

زمان استیپون (Stypven time) یا (Russell’s viper venom test (RVVT

اصول آزمایش

سم افعی راسل فعالیت ترومبوپلاستین دارد و قادر است که مسیر مشترک انعقاد را بدون نیاز به فاکتور هفت، فعال کند. با این آزمایش می‌توان کمبود فاکتور 7 انعقادی را شناسایی کرد. در کمبود فاکتور هفت آزمایش PT طولانی، ولی آزمایش RVVT نرمال می‌باشد. طولانی شدن زمان استیپون بیانگر کمبود در فاکتورهای مسیر مشترک انعقادی مانند فاکتورهای 10 یا 5 است.

زمان استیپون عبارت از زمان لازم جهت انعقاد پلاسما با افزودن سم افعی راسل به همراه یون کلسیم و فسفولیپید پلاکتی می‌باشد.

در مسیر انعقاد داخلی و خارجی، مسیر مشترک انعقادی وجود دارد که با آزمایش RVVT ارزیابی می‌گردد.

نکته مهم: یکی از کاربردهای مهم آزمایش RVVT در شناسایی بازدارنده لوپوس است. در حضور بازدارنده لوپوس آزمایش RVVT طولانی شده، ولی با تکرار آزمایش در مجاورت مقدار اضافی‌تر از فسفولیپید نرمال می‌شود.

سنجش عملکرد پلاکت‌ها در سیستم انعقاد خون

برای بند آمدن خونریزی نه تنها به شمارش کافی از پلاکت‌ها، بلکه به کارآمد بودن پلاکت‌ها نیز نیاز است. پلاکت‌ها با چسبیدن به رشته‌های کلاژن و انقباض رشته‌های اکتین و میوزین و با تراوش کردن محتویات گرانول‌های خود و بهم چسبیدن به یکدیگر در سیستم انعقاد خون شرکت می‌کنند.

با ظاهر شدن رشته‌های کلاژن و چسبیدن پلاکت‌ها به این رشته‌ها، شالوده انعقاد خون پی‌ریزی می‌شود.

آزمایش زمان سیلان (BT) و آزمایش کارآیی پلاکت‌ها با آنالیزور(platelet function analyser 100 (PFA-100 عملکرد پلاکتی در حین پاره شدن مویرگها را ارزیابی می‌کنند. زمان سیلان به روش template تکرارپذیری آزمایش BT را با استاندارد کردن طول و عمق برش پوستی، تحت کنترل در می‌آورد.

پلاکت‌ها با چسبیدن به رشته‌های کلاژن و چسبیدن به یکدیگر موجب تشکیل پلاک پلاکتی در محل بریدگی گشته و خونریزی را بند می‌آورند.

زمان سیلان

برای انجام آزمایش، دستگاه فشار خون را با فشار mmHg40 روی بازو در تمام زمان تست ثابت نگه دارید. فشار mmHg20 برای اطفال و نوزادان رضایت‌بخش است. با تیغه مخصوص (template) برشی به ابعاد mm1 ×mm5 طول و یک میلیمتر عمق روی سطح ساعد حدود 3 تا 5 سانتی‌متری زیر گودی آرنج ایجاد کنید.

برش mm1 ×mm 3/5 برای اطفال و mm 0/5 ×mm 2/5 برای نوزادان رضایت بخش است. برش می‌تواند افقی (به موازات چین‌های گودی آرنج) یا عمودی باشد. شانس ایجاد اسکار با برش عمودی کمتر است. ناحیه تولید برش بایستی عاری از خالکوبی، اسکار، جوش و بافت کلوئید (keloid) باشد. گفتنی است که برخی از افراد مستعد ایجاد کلوئید متعاقب زخم‌های پوستی هستند.

با مشاهده خروج خون از زخم ایجاد شده کرونومتر را به کار انداخته و قطرات خون خارج شده با کاغذ فیلتر از کناره های زخم پاک می‌شود (معمولاً هر 30 ثانیه یکبار قطرات خون از محل برش پاک می‌شود).

توجه داشته باشید که هیچگاه کاغذ فیلتر به لبه‌های زخم تماس پیدا نکند، زیرا موجب جدا شدن تجمع پلاکتی ازلبه‌های زخم و افزایش زمان سیلان می‌گردد. با رنگی نشدن کاغذ فیلتر اتمام زمان سیلان یادداشت می‌گردد.

برای آزمایش زمان سیلان دستگاه فشار خون برای افزایش فشار مویرگی بر روی بازو بسته می‌شود تا مشخص شود که آیا پلاکت‌ها می‌توانند در سیستم دینامیک و پر جنب و جوش عروقی خونریزی را بند آورند!!؟

دستگاه فشار خون را با پایان یافتن زمان سیلان برداشته و چنانچه می خواهید اطراف ناحیه برش را با پنبه الکل تمیز کنید، مواظب باشید که الکل به لبه‌های زخم تماس پیدا نکند. زیرا در غیر این صورت موجب درد شدید، خونریزی مجدد و افزایش شانس تولید اسکار می‌شود.

در پایان زمان سیلان با بانداژ کناره‌های زخم را بهم نزدیک کنید ولی دقت کنید که لبه‌های زخم روی هم قرار نگیرد. بانداژ بایستی تا 24 ساعت روی زخم باقی بماند.

با توجه به اینکه هر نمونه خون را بایستی بالقوه به عنوان یک عامل عفونی بشمار آورد از این‌رو بایستی تیغه مصرف شده در ظرف مقاوم به ابزار تیز (puncture resistant biohazard) و کاغذهای فیلتر آغشته به خون در کیسه مخصوص (biohazard bag) ریخته شود.

آزمایش زمان سیلان در تشخیص شدت بیماری فون ویلبراند و نواقص اکتسابی و ارثی پلاکتی کاربرد دارد و به طور کلی بایستی توجه کرد که به طور دقیق نمی‌توان با این آزمایش شدت خونریزی را پیش‌بینی نمود.

زمان سیلان در موارد زیر طولانی می‌شود:

1-   بیماری فون ویلبراند

2-   بیماری گلانزمن

3-   سندرم برنارد سولیر

4-   اختلال در منبع ذخیره ای پلاکت (storage pool deficiency)

5-   اورمی

6-     مایلوم مالتیپل

7-   کاهش یا فقدان فیبرینوژن

آسپرین با غیرفعال کردن آنزیم سیکلواکسیژناز برای حداقل 4 روز کارایی پلاکت در عمل تجمعی را کاهش می‌دهد.

آنتی‌بیوتیک‌های پني‌سیلین و سفالوسپورین کارایی پلاکت را تحت‌تأثیر قرار می‌دهند. هپارین و کومادین در دز دارویی اثری روی زمان سیلان ندارد.

کم‌خونی (هماتوکریت کمتر از 30%) موجب افزایش زمان سیلان می‌شود. چنانچه هر دو دست بیمار زخمی یا متورم و یا دارای تزریق محلول‌های وریدی باشد، می‌توان از ساق پا در 6 تا 8 سانتیمتری زیر زانو به عنوان محل برش استفاده کرد. در این حالت بیمار بایستی در وضعیت درازکش بوده و می‌توان دستگاه فشار خون را روی ران بست

ارتباط مستقیمی بین زمان سیلان و کاهش شمارش پلاکتی بین 10000 تا mm3/100000 وجود دارد. توجه داشته باشید که زمان سیلان با شمارش پلاکت بیشتر یا مساوی 100000 طبیعی می‌گردد. این رابطه عبارت است از:

BT = 30 – [ plat (10)3 / 4]

برای مثال در بیماری با شمارش پلاکت /mm340000 انتظار زمان سیلان 20 دقیقه بر اساس رابطه فوق می‌باشد (20=4/40-30=BT). چنانچه زمان سیلان اندازه‌گیری‌شده کوتاهتر از حد انتظار با توجه به فرمول فوق باشد، ممکن است بیانگر حضور پلاکت‌های درشت در خون بیمار باشد که از کارآیی بیشتری برخوردارند و چنانچه زمان سیلان اندازه‌گیری شده بیشتر از زمان قابل انتظار باشد. ممکن است بیانگر اختلال کیفی پلاکت در همراهی با کاهش پلاکت‌ها باشد، که برای مثال می‌توان به سندرم ویسکوت آلدریج اشاره کرد.

در گستره محیطی بیمار مبتلا به ترومبوسیتوپنی ایمونولوژیک (ITP ) پلاکت‌های درشت موجب موجب زمان سیلان کمتر از حد انتظار با توجه به رابطه فوق می‌گردند. برای مثال با پلاکت های 20000 انتظار زمان سیلان 25 دقیقه است ولی ممکن است اندازه‌گیری آن در آزمایشگاه زمان 10 دقیقه را نشان دهد که بیانگر حضور پلاکت های درشت و کارآمد در خون بیمار است.نمای فوق با پلاکت‌های درشت در بیماری برنارد سولیر هم مشاهده می‌شود ولی زمان سیلان اندازه‌گیری شده ممکن است بالغ بر 30 دقیقه گردد که از حد انتظار بالاتر بوده و بیانگر اختلال کیفی و کمی در پلاکت‌ها می‌باشد.

آنالیزور سنجش عملکرد پلاکتی (platelet functional analyzer) PFA-100

آنالیزور PFA-100 به ارزیابی کارآیی پلاکت‌ها در چسبیدن به رشته‌های کلاژن و گردهمایی آنها (aggregation) در یک سیستم دینامیک (high shear) می‌پردازد و برای این منظور نمونه خون کامل سیتراته بیمار تحت فشار از یک سوراخ که اطراف آن با کلاژن و محرک‌های دیگر پلاکتی از قبیل ADP و یا اپی‌نفرین آغشته شده است، عبور داده می‌شود. زمان انسداد سوراخ بر اثر چسبیدن و تجمع پلاکتی به نام زمان انسداد (closure time) گزارش می‌گردد که بسیار شببه به زمان سیلان است.

در آنالیزور PFA-100 عبور خون سیتراته از یک روزنه که اطراف آن با کلاژن یا محرک‌های پلاکتی پوشیده شده است موجب انسداد سوراخ به علت چسبیدن و تجمع پلاکتی می‌گردد. آنالیزور PFA-100شبیه به آزمایش BT بازسازی شده است.

 

آزمایش‌های روزمره انعقادی

برای ارزیابی و شناسایی علت خونریزی بایستی پروتئین‌های سیستم انعقاد، سیستم فیبرینولیتیک، شمارش پلاکت‌ها و عملکرد آنها مورد سنجش قرار گیرند.

سه آزمایش aPTT و PT و TT (زمان ترومبین) از آزمایش‌های روزمره انعقاد خون هستند.

در آزمایش PTT فعال‌شده یا aPTT حجم‌های مساوی از محلول حاوی سطوح با شارژ منفی و فسفولیپیدی برای فعال کردن فاکتورهای تماسی به‌ویژه 12 بهمراه پلاسمای بیمار در 37 درجه انکوبه شده و بعد از 3 تا 5 دقیقه کلرور کلسیم mM30 به لوله آزمایش اضافه شده و زمان لازم برای تولید لخته فیبرینی اندازه‌گیری می‌شود. آزمایش PTT مسیر داخلی انعقاد را ارزیابی کرده و کمبود هر فاکتور انعقادی بجز 7 و 13 موجب طولانی شدن آزمایش می‌گردد.

مسیر داخلی انعقاد خــون یک پدیده آزمایشــگاهی اســت که بـا آزمایش aPTT(activated partial thromboplastin time) یا زمان نسبی (پارشیال) ترومبوپلاستین ارزیابی می‌شود. در این مسیر تمام فاکتورهای انعقادی به جز 7 و 13 شرکت دارند. مواد شارژدار منفی از قبیل کائولین، سلیت و الاژیک اسید قادر به خودفعال‌سازی فاکتور 12 انعقاد می‌گردند.

برای آزمایش PT یا زمان پروترومبین معرف فاکتور بافتی و یون کلسیم به پلاسمای بیمار اضافه شده و زمان لازم جهت انعقاد پلاسما اندازه‌گیری می‌شود. آزمایش PT مسیر فیزیولوژیک انعقاد را بررسی نمی‌کند، بلکه فاکتور بافتی اضافه شده در لوله آزمایش فاکتور 7 را فعال کرده و با آن ایجاد کمپلکس (tissue factor/VIIa) می‌کند، این کمپلکس مستقیماً فاکتور 10 را فعال می‌کند. در مسیر آزمایش PT کارآیی فاکتورهای 1 و 2 و 5 و 7 و 10 مورد سنجش قرار می‌گیرند. گفتنی است که سه فاکتور 2 و 7 و 10 در گروه فاکتورهای وابسته به ویتامین K هستند.

مسیر خارجی انعقاد یک پدیده آزمایشگاهی است که با آزمایش PT ارزیابی می گردد. این مسیر وابسته به فاکتورهای وابسته به ویتامین K به‌ویژه فاکتور 7 می‌باشد.

در آزمایش های انعقادی نقطه پایان (end point) آزمایش تولید پلیمرهای فیبرینی می‌باشد. ترومبین با جدا کردن فیبرینوپپتیدهای  AوB از مولکول فیبرینوژن آن را به فیبرین تبدیل می‌کند.

آزمایش PT فاکتورهای انعقادی مسیر خارجی (10 و 7 و 5 و 2 و 1) را ارزیابی می‌کند و گفتنی است که سه فاکتور از 4 فاکتور وابسته به ویتامین K یعنی 2 و 7 و 10 در این مسیر قرار دارند و از این‌رو آزمایشی مناسب در پیگیری درمان با آنتاگونیست‌های ویتامین K مانند وارفارین است که به عنوان داروی ضد انعقاد کاربردی گسترده دارد.

فاکتورهای انعقادی 2و7و9و10 و پروتئین‌های تنظیم‌گر انعقاد مانند پروتئین‌های Z,S,C برای کارآیی احتیاج به ویتامین K دارند. آنزیم کربوکسیلاز (Carboxylase ) کبدی با کوفاکتور احیاء شده ویتامین K موجب کربوکسیله کردن اسید آمینه‌های گلوتامیک در فاکتورهای فوق پس از ترجمه آن‌ها می‌گردد.این فرآیند با تولید میدان Gla در فاکتورهای فوق امکان ارتباط با کلسیم و فسفولیپیدهای با شارژ منفی که برای پروسه انعقاد اساسی است را فراهم می‌آورد. ویتامین K احیا شده در فرآیند کربوکسیله شدن گلوتامیک اسید به فرم اکسید شده یا اپوکسید در‌می‌آید که توسط آنزیم ردوکتاز کبدی دوباره به فرم احیاء شده درآمده و وارد چرخه می‌شود. وارفارین با جلوگیری از چرخه احیاء ویتامین K از تولید میدان Gla و در نتیجه از کارآیی فاکتورهای 2و7و9و10 جلوگیری می‌کند.

واحد (international normalized ratio) INR یا نسبت همسو شده بین‌المللی یکی از شیوه‌های گزارش آزمایش PT بر مبنای معرف فاکتور بافتی استاندارد شده یا همسو شده با معرف بافتی مرجع WHO می‌باشد. به بیان دیگر اگر آزمایش PT بیمار با معرف بافتی مرجع انجام شود نسبت PT بیمار به کنترل برابر INR می‌گردد.

(international sensitivity index) ISI یا نشانگان حساسیت بین‌المللی، حساسیت معرف PT به کمبود فاکتورهای وابسته به ویتامین K در مسیر خارجی را نشان می‌دهد و مقدار آن از عدد یک تا 3 متغیر است. هر چه مقدار عددی ISI به یک نزدیک شود بیانگر معرف بسیار حساس و چنانچه به عدد 3 نزدیک شود بیانگر کاهش حساسیت آن است.

عصاره مغز و جفت و ریه سرشار از فاکتور بافتی است و هنگامی که معرف فاکتور بافتی از یک شرکت سازنده ضریب ISI را از WHO دریافت دارد به مفهوم معادل‌سازی یا همسوسازی آن با معرف بافتی تولید شده از سوی WHO است.

معرف مرجع WHO از مغز انسان تهیه شده است و دارای ISI=1 می‌باشد.

برای محاسبه INR از رابطه زیر استفاده می‌شود:

INR=

مثال: چنانچه PT پلاسمای کنترل و بیماری با معرف بافتی (ترومبوپلاستین) یک شرکت سازنده که از مغز خرگوش تهیه شده، بترتیب 12 و 24 ثانیه و دارای ISI=2 باشد.

INR=

بدین مفهوم که اگر آزمایش PT بیمار با معرف مرجع WHO انجام می‌شد نسبت آزمایش بیمار به پلاسمای کنترل عدد 4 بود.

هر چه ISI به عدد یک نزدیک شود آزمایش PT در کمبود فاکتورهای وابسته به ویتامین K به سرعت طولانی می‌گردد و هرچه به عدد 3 نزدیک شود به کندی طولانی می‌گردد. ولی محاسبه INR آزمایش PT را غیروابسته به معرف بافتی کرده و مثل این است که در هر جای دنیا که از واحد INR استفاده می‌شود از یک نوع معرف شبیه فاکتور بافتی تولید شده از سوی WHO استفاده می‌کنند.

برای سهولت درک مطلب به مثال زیر توجه کنید:

آزمایش PT بیماری که وارفارین مصرف می‌کند در یک آزمایشگاه با معرف بافتی با 3/2=ISI برابر 22 ثانیه با کنترل 13 ثانیه و آزمایش PT همان نمونه در آزمایشگاه دیگر با معرف بافتی با 3/1=ISI برابر 30 ثانیه با کنترل 12 ثانیه شده است تفسیر آزمایش بیمار چگونه است ؟

(آزمایشگاه اول) INR=

(آزمایشگاه دوم) INR=

با توجه به اینکه ISI آزمایشگاه دوم نزدیک به عدد یک و بسیار حساس است از این‌رو آزمایش PT به سرعت طولانی شده و عدد بالاتری در کمبود فاکتورهای وابسته به ویتامین K نشان داده است. ولی مقدار ISI در آزمایشگاه اول نزدیک به عدد3  بوده که بیانگر کاهش حساسیت معرف بوده و از این‌رو زمان آزمایش PT کمتر طولانی شده است. ولی توجه داشته باشید که مقدار ISI جواب هر دو آزمایشگاه را همسو کرده و حساسیت زیاد و یا حساسیت کم معرف‌ها را جبران کرده است و از این‌رو هر دو مورد دارای INR یکسان هستند.

نکات مهم آزمایشگاهی برای آزمایش‌های انعقادی:

•ü     ضد انعقاد مناسب برای آزمایش‌های انعقادی (PT و PTT و …) سیترات سدیم 105 تا 109 میلی‌مول در لیتر است که برای این منظور 13/3 یا 2/3 گرم Na3C6H5O7.2H2O را در 100 سی‌سی آب مقطر حل کرده و در یخچال نگه‌داری می‌شود.

•ü     برای آزمایش‌های انعقادی مانند PT و PTT به 9 حجم خون یک حجم سیترات سدیم اضافه می‌شود. حداکثر تا یک دقیقه پس از خون‌گیری بایستی نمونه خون را با سیترات سدیم با واژگون‌کردن (inversion) لوله آزمایش مخلوط کرد. برای مثال برای تهیه 2 سی‌سی خون مقدار 2/0 سیترات با 8/1 سی‌سی خون به حجم 2 سی‌سی رسانیده می‌شود.

•ü     چنانچه هماتوکریت بیماری بیشتر از 55% باشد بایستی مقدار سیترات با توجه به هماتوکریت تنظیم گردد. در غیر این صورت سیترات اضافی در حجم کم پلاسمای بیمار پرخون‌، با پیوند به کلسیم اضافه شده در هنگام آزمایش موجب طولانی شدن کاذب آزمایش می‌شود.

•ü     برای محاسبه سیترات لازم در هماتوکریت‌های بالا می‌توان از رابطه‌های زیر استفاده کرد.

 حجم سیترات موردنیاز به ازای هر سی‌سی خون=

یا

V × (PCV-100) (3- 10 ×85/1)= حجم سیترات مورد نیاز

در رابطه‌های فوق PCV (هماتوکریت) و V برابر حجم خون موردنیاز است.

برای مثال: چه حجم از سیترات سدیم برای تهیه cc2 خون جهت PT وPTT بیماری با هماتوکریت 60% لازم است؟

حجم سیترات برای هر سی‌سی خون=

مقدار 0.07 سی‌سی از سیترات سدیم برای یک سی‌سی خون می‌باشد و از این رو برای تهیه 2 سی‌سی مقدار آن در عدد 2 ضرب می‌شود. بدین مفهوم که 14/0 سی‌سی سیترات سدیم در لوله ریخته و با خون به حجم cc2 رسانیده می‌شود. برای محاسبه حجم سیترات برای 2 سی‌سی خون با هماتوکریت 60% می‌توان از رابطه دوم نیز استفاده کرد:

 

                        cc14/0= 2 × (60-100) (3- 10 ×85/1)= حجم سیترات موردنیاز

برای هماتوکریت‌های کمتر از 50% می‌توان به طور روزمره 2/0 سی‌سی سیترات سدیم را با 8/1 سی‌سی خون مخلوط کرد ولی برای هماتوکریت‌های بالا حتماً نیاز به محاسبه مقدار ضد انعقاد می‌باشد.

•ü     چنانچه با سیستم لوله‌های خلأدار از طریق یک سوزن وریدی نمونه‌های مختلف برای آزمایش‌های گوناگون تهیه می‌شود، نمونه مربوط به آزمایش‌های انعقادی بایستی اول گرفته شود زیرا آلودگی سوزن نمونه‌گیری با محتویات لوله‌های دیگر مانند EDTA و یا ژل فعال‌کننده لخته در آزمایش‌های انعقادی تداخل ایجاد می‌کنند.  

نمونه گیری با استفاده از سیستم‌های خلأدار

•ü     برای آزمایش‌های انعقادی از تهیه نمونه خون از مسیرهای آغشته به هپارین (مانند کاتترهای وریدی) و از مسیرهای تزریق محلول‌های وریدی خودداری کنید. در موارد اضطراری بایستی مسیر وریدی را با cc5 سالین شستشو داد و سپس 5 سی‌سی اول را دور ریخت و از آن پس اقدام به جمع‌آوری نمونه خون کرد.

•ü     وجود هر گونه لخته، همولیز قابل رؤیت و نمونه با حجم کمتر از مقدار لازم، آزمایش‌های انعقادی را فاقد اعتبار می‌کند.

•ü     افزایش حجم نمونه تا 10% حجم واقعی می‌تواند مورد پذیرش قرار گیرد. بعنوان مثال برای 2 سی‌سی نمونه تا افزایش 2/0 سی‌سی نمونه (2/2) قابل قبول می‌باشد.

•ü      آزمایش‌های انعقادی به‌ویژه آزمایش شناسایی آنتی‌بادی‌های ضد فسفولیپیدی را بایستی با پلاسمای فاقد پلاکت (کمتر از 10000 در میلی‌متر مکعب از پلاسما) انجام داد .ولی آزمایش‌های PT و PTT روی پلاسمای پلاکت‌دار هم بلامانع است و این به‌علت آن است که معرف‌های PT و PTT هم دارای مقدار اضافی از جایگزین فسفولیپید پلاکتی هستند. توجه داشته باشید که برای منجمد کردن پلاسما بایستی از پلاسمای فاقد پلاکت استفاده کرد.

•ü     پلاسمای لیپیدی شیری رنگ (Lipemic) و پلاسمای زرد رنگ (ژاندیس) و پلاسمای قرمز (نمونه همولیز) ممکن است در دستگاه کوآگولومتر که نقطه پایان آزمایش بر مبنای نورسنجی (optic) قرائت می‌شود ایجاد خطا کرده و از این‌رو انجام دستی آزمایش در موارد فوق سفارش می‌شود.

•ü     فاصله زمان نمونه‌گیری تا انجام آزمایش‌های انعقادی وابسته به درجه حرارت نگهداری نمونه است. آزمایش PT با نگهداری نمونه خون در لوله سربسته در دمای 24 -18 درجه (نمونه سانتر‌يفوژ شده یا سانتریفوژ نشده) تا 24 ساعت از نمونه‌گیری بلامانع است.

•ü  نگهداری پلاسما در 2 تا 4 درجه موجب فعال شدن فاکتور هفت در سرما (cold autoactivation) شده و زمان PT را 2 تا 3 ثانیه کوتاه می‌کند، از این‌رو بهتر است که اگر امکان انجام آزمایش PT تا 24 ساعت از نگهداری نمونه در حرارت اتاق نباشد اقدام به منجمد کردن پلاسما کرد.

•ü     آزمایش PTT نمونه‌های غیرهپارینه (سانتریفوژ شده یا نشده) در لوله سربسته در 2 تا 4 درجه یا 18 تا 24 درجه تا 4 ساعت از نمونه‌گیری بایستی انجام شود.

•ü     نمونه‌های مربوط به بیمارانی که روی درمان هپارین می‌باشند (هپارین UFH) با نگهداری در دمای 2 تا 4 درجه یا 18 تا 24 درجه بایستی در یک ساعت سانتريفوژ و پلاسما جدا شود. آزمایش PTT تا 4 ساعت بر روی پلاسمای نگه‌داری شده در 2 تا 4 درجه بلامانع است.

•ü     چنانچه بیماری همزمان روی درمان با ضد انعقادهای وارفارین و هپارین است و بیمار نیاز به آزمایش PT جهت پیدا کردن دُز درمانی با وارفارین دارد بایستی از کیت‌های PT که دارای خنثی‌کننده هپارین هستند استفاده کرد. گفتنی است که هپارین به‌ویژه در مقدار زیاد می‌تواند PT را طولانی کند از این‌رو برخی از کیت‌های PT دارای هپاریناز (heparinase) و یا دارای سلولز جهت برداشت هپارین از نمونه هستند. شرایط نگه‌داری نمونه در حالت فوق مانند نمونه هپارینه است.

•ü     بایستی برای آزمایش‌های دیگر انعقادی که نمونه در دمای 2 تا 4 درجه یا 18 تا 24 درجه نگه‌داری می‌شوند، پلاسما را جدا کرده و ظرف 4 ساعت اقدام به انجام آزمایش کرد.

•ü     چنانچه امکان انجام آزمایش در 24 ساعت برای PT و یا 4 ساعت برای PTT نباشد. پلاسما را جدا کرده و در 20- درجه برای دو هفته و یا در 70– درجه برای 6 ماه قرار دهید. پلاسمای منجمد شده را بایستی بسرعت در 37 درجه آب کرده و حداکثر تا 2 ساعت از نگهداری آن در 4 درجه اقدام به انجام آزمایش گردد.

•ü     آزمایش‌های انعقادی به صورت دوبل انجام و میانگین نتایج گزارش می‌شود. چنانچه از رعایت استانداردهای تجهیزات اتوماتیک اطمینان دارید آزمایش به صورت تکی نیز قابل قبول است.

•ü     آزمایش PTT وابسته به تمام فاکتورهای مسیر داخلی (همه فاکتورها بجز 13 و 7) است و کاهش 15 تا 30 درصدی هر کدام از آنها موجب طولانی شدن آزمایش می گردد.

نکته بسیار مهم: افزایش بیش از حد یک فاکتور انعقادی ممکن است آزمایش PTT را در حضور کمبود فاکتورهای دیگر انعقادی نرمال کرده و بر کمبود آنها پوشش گذارد. حالت فوق در افزایش شدید فاکتور 8 ممکن است رخ دهد. گفتنی است که فاکتورهای 8 و فون ویلبراند و فیبرینوژن در گروه پروتئین‌های فاز حاد بوده و بیماری‌های التهابی منجر به افزایش سطح آنها می‌گردند.

نکته مهم: آزمایش PT و PTT در افزایش شدید فاکتورهای انعقادی ممکن است کمتر از زمان پلاسمای کنترل باشند.

نکته مهم: کمبود فاکتورهای تماسی مانند 12، پره کالیکرئین (فاکتور فلچر) و کینینوژن با وزن مولکولی زیاد (فاکتور فیتزجرالد) گرچه موجب طولانی شدن PTT می‌گردند ولی بیمار در موارد فوق میلی به خونریزی نداشته و اعمال جراحی بدون هیچ نگرانی و بدون جایگزین کردن فاکتورها انجام می‌شود.

گفتنی است که آزمایش طولانی PTT به علت کمبود پره‌کالیکرین با تماس بیشتر پلاسما با شیشه (مثلاً 15 دقیقه انکوباسیون پلاسما بجای 2 تا 3 دقیقه استاندارد) نرمال می‌شود. به کارگیری محلول‌های فعال‌کننده سطحی مانند اسیدالاژیک نیز موجب نرمال شدن PTT در کمبود پره‌کالیکرین می‌گردد. یادآوری می‌شود که در آزمایش PTT به پلاسمای بیمار فعال‌کننده‌های سطحی مانند کائولین یا سلیت (celite) یا الاژیک اسید به همراه یون کلسیم و جایگزین فسفولیپید پلاکتی به لوله آزمایش اضافه شده و زمان لخته شدن پلاسما مورد سنجش قرار می‌گیرد.

•ü     افزایش زمان PTT همراه با آزمایش PT نرمال و بدون سابقه خونریزی ممکن است دال بر کمبود فاکتورهای تماسی مانند 12 و پره‌کالیکرئین و کینینوژن باشد. گفتنی است که بازدارنده لوپوس هم ممکن است با افزایش PTT و بدون خونریزی بلکه با ترومبوز همراه باشد.

نرمال بودن آزمایش‌های PTT و PT و همچنین شمارش پلاکت و کارآیی آن در بیمار مبتلا به خونریزی احتمال کمبود فاکتور 13 یا کمبود α2– آنتی پلاسمین یا اختلال در کمبود بازدارنده‌های فعال‌کننده پلاسمینوژن را مطرح می‌کند.

•ü     کمبود  فیبرینوژن بینmg% 100-80  موجب طولانی شدن تمام آزمایشات انعقادی که نقطه پایان آنها (end point) بر اساس تشکیل لخته است، می‌شود.

•ü     دمای انکوباتور برای آزمایش‌های انعقادی بایستی در محدوده 1 ± 37 درجه بوده و پلاسمای بیمار و کنترل هیچگاه قبل از انجام آزمایش‌های انعقادی بیشتر از 10 دقیقه در 37 درجه قرار نگیرد.

•ü     حضور بازدارنده لوپوس ممکن است منجر به طولانی شدن PTT گردد، در این حالت طولانی بودن PTT با خونریزی همراه نبوده و بر عکس با خطر ایجاد ترومبوز همراه است.

•ü     ترومبین با جدا کردن فیبرینوپپتیدهای A و B از مولکول فیبرینوژن آن را به فیبرین تبدیل می‌کند. جدا شدن فیبرینوپپتید A برای ایجاد لخته بسیار اساسی و اختلال آن موجب طولانی شدن PT و PTT و خونریزی می‌گردد در حالی که اختلال در جدا کردن فیبرینوپپتید B گرچه آزمون‌های انعقادی را طولانی می‌کند ولی با خونریزی همراه نیست. فیبرینوپپتید B در بهم چسبیدن منومرهای فیبرین نقش دارد.

پرکاری سیستم فیرینولیتیک از قبیل کاهش α2– آنتی‌پلاسمین و کاهش بازدارنده‌های فیبرینولیتیک موجب آب شدن سریع لخته توسط آنزیم پلاسمین می‌گردد. در این حالت، با وجود خونریزی در بیمار، آزمایش‌های PT و PTT طبیعی است.

نکته مهم: الگوی موجی‌شکل دو مرحله‌ای (biphasic transmittance waveform) در آزمایشات انعقادی به‌ویژه آزمایش PTT مربوط به کمپلکس CRP با لیپوپروتئین‌های با دانسیته بسیار پایین (VLDL) بوده که در حضور کلسیم رسوب می‌کنند. الگوی دوفازی موجی شکل aPTT در عفونت‌های خونی، بیماران بدحال در بخش  ICUو در بیماران مبتلا به انعقاد داخل عروقی منتشره مشاهده شده و ادعا گردیده که مارکر اولیه برای DIC می‌باشد.

در دستگاه‌های مبتنی بر سنجش تشکیل لخته (clot end point) زمان لخته شدن پلاسما به‌محض ایجاد تغییرات ناگهانی در عبور نور تابشی (transmittance) ثبت می‌گردد، ولی گاهی کمپلکس‌های VLDL-CRP قبل از ایجاد لخته نهایی با تشکیل رسوب ایجاد یک شیب اولیه در کاهش عبور نور تابشی (transmittance) کرده که به دنبال آن با تشکیل لخته نهایی یک شیب ناگهانی دیگر در کاهش عبور نور مشاهده شده که از آن پس منحنی عبورنور یکنواخت می‌گردد. به این حالت الگوی موجی شکل دو مرحله‌ای گویند.

منحنی آزمایش PTT در دستگاه کوآگولومتر روی محور مختصات که محور x بر حسب ثانیه و محور y بر اساس عبور نور (transmittance) درجه‌بندی شده است، ترسیم می‌گردد. گراف A آزمایش PTT تک‌ موج را نشان می‌دهد که زمان لخته با تغییر ناگهانی در کاهش نور تابشی همراه است.گراف B آزمایش دو فازی یا مواج PTT را نشان می‌دهد که موج اول کاهش عبور نور تابشی ناشی از رسوب CRP–VLDL و موج دوم به علت تولید لخته نهایی است.

آزمايش مخلوط پلاسماي بيمار با پلاسماي کنترل (Mixing study)

هنگامي که آزمايش PTT يا PT بيماري طولاني شود براي شناسايي علت طولاني شدن اقدام به آزمايش مخلوط (mixing) مي‌گردد که در غالب موارد حجم‌هاي مساوي (mixing 1:1) از پلاسماي بيمار و کنترل را مخلوط کرده و اقدام به آزمايش مجدد تست طولاني شده، مي‌گردد.

برای تهیه حوضچه پلاسمای کنترل(Control pool plasma ) دست‌کم از 6 فرد سالم (زن و مرد) نمونه خون سیتراته گرفته و پلاسمای آنها مخلوط می‌گردد. توجه داشته باشید که حاملگی و یا بیماری‌های عفونی و التهابی موجب افزایش فاکتورهای فاز حاد انعقاد مانند فاکتورهای 8 و فیبرینوژن می‌گردند. سطح هر فاکتور انعقادی در حوضچه پلاسمای نرمال برابر 100% فرض می‌شود. سطح فاکتورهای انعقادی در افراد سالم جامعه ممکن است بین 50 تا 150 درصد نسبت به سطح فاکتورهای موجود در حوضچه پلاسمای کنترل باشد. پلاسمای کنترل در حجم‌های 5/0 سی‌سی در دمای 20– درجه برای 2 هفته و در 70- درجه برای 6 ماه قابل نگه‌داری می‌باشد.

تفسير آزمايش پلاسماي مخلوط در بیماری با PTT طولانی

1-    آزمايش PTT را روي مخلوط هم حجم از پلاسماي بيمار و کنترل به صورت فوري انجام دهيد. چنانچه PTT تصحيح شد (بدين مفهوم که برابر با PTT پلاسمای نرمال يا حداکثر 5 ثانيه بيشتر از نرمال) بيانگر کمبود فاکتورهاي انعقادي بوده و آزمايش سنجش فاکتورهاي انعقادي سفارش مي‌شود.

2-    چنانچه آزمايش PTT با پلاسماي مخلوط طولاني بود و تکرار آزمايش با افزايش فسفوليپيد اضافي نرمال شد به بازدارنده لوپوس فکر کنيد. براي تهيه منبع فسفوليپيد در آزمايشگاه مي‌توان پلاکت‌هاي يک شخص را شستشو داد و سپس آنها را منجمد و آب کرد.

3-    چنانچه آزمايش فوري PTT روي پلاسماي مخلوط ابتدا تصحيح شود ولي با انکوبه کردن مخلوط پلاسما به مدت 2 ساعت در 37 درجه طولاني گردد، بيانگر آنتي‌بادي عليه فاکتورهاي انعقادي به‌ويژه فاکتور 8 مي‌باشد.

توجه داشته باشيد که آنتي‌بادي عليه فاکتور 8 با گذشت زمان فاکتور 8 را خنثي مي‌کند و منجر به طولاني شدن PTT پلاسماي مخلوط مي‌گردد. در بازدارنده لوپوس و کمبود فاکتورهاي انعقادي آزمايش PTT پلاسماي مخلوط در زمان فوري و بعد از 2 ساعت طولاني مي‌ماند.

نکته مهم:

1-    از پلاسماي فاقد پلاکت (پلاسمايي که با سانتريفوژ تهيه شده و تعداد پلاکت‌ها در آن کمتر از 10000 در ميلي‌متر مکعب است) براي شناسايي آنتي‌بادي‌هاي ضد فسفوليپيدي استفاده مي‌شود. لاشه‌ها و فسفوليپيدهاي پلاکتي قادر به خنثي کردن آنتی‌بادی‌های ضد فسفولیپیدی و در نتيجه منفي کاذب در آزمايش‌هاي شناسايي آنتی‌بادی‌های ضد فسفوليپيدی مي‌گردد.

اندازه‌گیری فیبرینوژن

فیبرینوژن را می‌توان بر پایه آزمایش‌های انعقادی مانند زمان ترومبین و زمان رپتیلاز اندازه‌گیری کرد. آنزیم ترومبین با جدا کردن فیبرینوپپتیدهای A و B از مولکول فیبرینوژن‌، آن‌را به فیبرین تبدیل می‌کند در حالی‌که آنزیم رپتیلاز تنها با جدا کردن فیبرینوپپتید A از فیبرینوژن آن‌را به فیبرین تبدیل می‌کند.

 

فیبرینوژن مولکولی متقارن است که از سه زوج زنجیره آلفا و بتا و گاما تشکیل شده است. فیبرینوپپتیدهای  AوB در مرکز تقارن فیبرینوژن یا میدان E قرار دارند.پلیمری شدن منومرهای فیبرین شبکه پلیمری لخته را تولید می‌کند.

جداشدن فیبرینوپپتید A برای ایجاد لخته و جلوگیری از خونریزی نقش مهمی دارد. درحالی‌که فیبرینوپپتید B در پلیمری شدن بهتر منومرهای فیبرین شرکت می‌کنند.

زمان ترومبین (Thrombin Time ) و زمان رپتیلاز (Reptilase Time ) نسبت عکس با مقدار فیبرینوژن دارد. برای اندازه‌گیری فیبرینوژن بایستی نخست گراف استاندارد را رسم کرد. گراف استاندارد ارتباط بین زمان ترومبین یا رپتیلاز با مقدار فیبرینوژن می‌باشد. بدین مفهوم که استاندارد فیبرینوژن در رقت‌های مختلف مورد آزمایش زمان ترومبین یا رپتیلاز قرار می‌گیرند. برای مثال اگر غلظت استاندارد فیبرینوژن mg%300 باشد و به طور قراردادی رقت 1:5 آن برابر mg%300 گرفته شود، رقت 1:10 آن معادل mg%150 و 1:20 آن معادل mg%75 خواهد بود. برای اندازه‌گیری فیبرینوژن، پلاسمای بیمار را 1:5 رقیق کرده و با محاسبه زمان ترومبین یا رپتیلاز غلظت فیبرینوژن را از روی گراف تعیین می‌کنیم. دقت کنید که چنانچه پلاسما یا استاندارد رقیق نشوند اشتباه یک ثانیه‌ای در خواندن زمان انعقاد تأثیر زیادی روی غلظت فیبرینوژن دارد، ولی با رقیق سازی و طولانی کردن زمان این حساسیت از بین می‌رود.

مقدار نرمال فیبرینوژن 350-150 میلی گرم درصد است. فیبرینوژن جزء گلوبولین‌های بتا است.

نکته‌های مهم در اندازه‌گیری فیبرینوژن

1-    هپارین درمانی یا آلوده شدن نمونه خون به هپارین موجب طولانی شدن زمان ترومبین و کاهش کاذب مقدار فیبرینوژن می‌گردد. هپارین، آنزیم ترومبین را خنثی می‌کند و از این‌رو در مجاورت هپارین نمی‌توان از آزمایش زمان ترومبین برای اندازه‌گیری فیبرینوژن استفاده کرد. در این موارد می‌توان از زمان رپتیلاز استفاده کرد. آنزیم رپتیلاز توسط ترومبین خنثی نمی‌شود.

2-    غلظت زیاد اجزای پپتیدی فیبرین و فیبرینوژن (d-dimer, FDP) مانع پلیمری شدن فیبرین گردیده و از این‌رو با افزایش زمان انعقاد موجب کاهش کاذب فیبرینوژن می‌گردند. اجزای پپتیدی فیبرین و فیبرینوژن در انعقاد داخل عروقی منتشره افزایش می‌یابد.

3-    افزایش سطح پاراپروتئین‌ها در مایلوم مالتیپل با دخالت در پلیمری شدن فیبرین، زمان ترومبین و رپتیلاز را افزایش می‌دهند.

4-    در دیس‌فیبرینوژنمی (dysfibrinogenemia) سطح فیبرینوژن کارآمد که با آزمایش‌های انعقادی اندازه‌گیری می‌شود، کمتر از سطح آنتی‌ژنی اندازه‌گیری شده با روش‌های شیمیایی یا آزمایش‌های بر پایه واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی می‌باشد.

نکته: فیبرینوژن و فاکتور  8 و فاکتور فون ویلبراند جزء پروتئین‌های فاز حاد بوده و در بیماری‌های التهابی افزایش می‌یابد. از اندازه‌گیری فیبرینوژن برای پیگیری انعقاد داخل عروقی منتشره به‌ویژه در جنین مرده نگه‌داری شده استفاده می‌شود. افت سریال فیبرینوژن در خانم حامله دارای پیش‌آگهی نامطلوب است.

گفتنی است که فیبرینوژن در حاملگی افزایش می‌یابد و از این‌رو میزان پایه در یک خانم حامله ممکن است 500 یا 800 میلی‌گرم باشد، بنابراين در تفسیر میزان فیبرینوژن در خانم حامله بایستی دقت کرد.

تزریق خون حجیم (Massive ) با کاهش فاکتورهای انعقادی به ویژه فیبرینوژن ممکن است موجب خون‌ریزی شود. برای ثبات انعقادی بایستی حداقل سطح فیبرینوژن mg%100 باشد. تزریق هر کیسه کرایو به ازای هر 10 کیلوگرم % mg 50 فیبرینوژن را افزایش مي‌دهد.

داروی ال آسپارژیناز، والپورات سدیم و بیماری کبد و سندرم هیپرفیبرینولیز موجب کاهش فیبرینوژن می‌شوند.

 

کمبود فاکتور 13 و آزمایش تشخیصی آن

فاکتور 13 یا فاکتور پایدار کننده فیبرین عهده‌دار انسجام شبکه فیبرینی و جلوگیری از پاشیده شدن آن است. فاکتور 13 توسط آنزیم ترومبین، فعال و نقش ترانس‌ گلوتامیناز یا ترانس‌آمیداز دارد بدین مفهوم که بین رشته‌های آلفا و گاما از مولکول‌های فیبرین ایجاد پیوند آمیدی(C=O-NH) بین اسید آمینه‌های گلوتامیک و لیزین می‌کند.

فاکتور 13 به صورت تترامر از دو واحد کاتالیز کننده (A) و دو واحد حامل (B) تشکیل یافته است. مقدار کمی از فاکتور 13 در پلاکت و منوسیت نیز وجود دارد.

فاکتور 13 نه تنها با اتصالات عرضی (cross link) لخته فیبرینی را محکم می‌کند، بلکه با ایجاد اتصالات با مواد زمینه‌ای در اطراف لخته در محکم چسباندن لخته به ناحیه آسیب عروقی نقش دارد. جالب اینکه فاکتور 13 با احتباس آنتی پلاسمین در لخته تازه تولید شده آن‌را از هجوم پلاسمین در امان نگه می‌دارد.

فاکتور 13 فعال با ایجاد اتصالات عرضی شبکه فیبرینی را محکم می‌کند. در کمبود فاکتور 13 لخته‌‌ای که تازه تولید شده به سرعت از هم‌پاشیده و بیمار میل به خونریزی پیدا می‌کند.

از مهمترین علایم کمبود فاکتور 13 خونریزی‌های تأخیری و سیکل‌های متعدد خونریزی است. خونریزی در بافت نرم به صورت کیست هموراژیک و تا 25% با شیوع خونریزی مغزی همراه است. سقط مکرر به علت نچسبیدن جفت به رحم و خونریزی از بندناف و تأخیر در ترمیم زخم به علت اختلال در رگ‌سازی (angiogenesis) از علایم دیگر کمبود فاکتور 13 است.

خونریزی تأخیری به مفهوم آن است که بعد از یک حادثه خون‌ریزی دهنده سیستم انعقاد با تشکیل فیبرین خون را بند می‌آورد ولی چون شبکه فیبرینی بر اثر نبود فاکتور 13 از هم می‌پاشد، خونریزی دو‌مرتبه شروع شده و این چرخه خونریزی و بند آمدن تا درمان ادامه می‌یابد.

گفتنی است که غلظت 5% از فاکتور 13 برای عملکرد آن کافی بوده و علایم بالینی در کمبود یک تا 2 درصدی آن دیده می‌شود.

کاهش فاکتور 13 علاوه بر موارد ارثی در پورپورای هنوخ (henoch-schonlein) و بیماری التهابی روده مشاهده شده است. مصرف داروهایی مانند ایزونیازید و فنی‌توئین همراه با شکل‌گیری بازدارنده علیه فاکتور 13 است.

نکته مهم

در کمبود فاکتور 13 تمام آزمایش‌های انعقادی که نقطه پایان آن‌ها بر اساس تولید لخته است از قبیل PT و PTT و… طبیعی است و این در حالی است که بیمار میل به خونریزی دارد. گفتنی است که نقطه پایان تست‌های فوق زمان انسجام لخته نیست بلکه تولید شبکه پلیمری فیبرین می‌باشد.

آزمایش پایداری لخته در اوره 5 مولار

لخته ناپایدار به علت فقدان فاکتور 13 یا وجود بازدارنده علیه فاکتور 13 در محلول اوره 5 مولار یا یک درصد منوکلرواستیک اسید حل شده در حالی که لخته پایدار شده در حضور فاکتور 13، حداقل به‌مدت 24 ساعت در محلول‌های فوق پایدار می‌ماند.

 

روش آزمایش

1-    سه لوله آزمایش 1 و 2 و 3 را نشانه‌گذاری کرده و در لوله اول 3/0 سی‌سی پلاسمای فاقد پلاکت بیمار و در لوله سوم 3/0 سی‌سی پلاسمای نرمال فاقد پلاکت اضافه کنید. به لوله دوم 2/0 سی‌سی پلاسمای بیمار و 1/0 سی‌سی پلاسمای نرمال اضافه کنید.

2-    به هر لوله 1/0 سی‌سی از محلول 025/0 مولار کلرور کلسیم اضافه کرده و لوله‌ها را بمدت 30 دقیقه در 37 درجه بگذارید تا لخته فیبرینی ایجاد گردد.

3-    به هر لوله 3 سی‌سی محلول اوره 5 مولار اضافه کرده و سر آن را پوشانده و با حرکت دادن لوله، لخته را جدا کرده تا در محلول اوره قرار گیرد.

4-    لوله‌ها را در حرارت اتاق برای مدت 24 ساعت نگهداری کرده و وضعیت لخته یا کدر شدن محلول در زمان‌های 1 و 2 و 4 و 24 ساعت مورد ارزیابی قرار می‌گیرد. کوچک شدن اندازه لخته، شکسته شدن لخته و کدر شدن محلول اوره علامت ناپایداری لخته است.

وضعیت لخته در لوله شماره یک با وضعیت لخته نرمال در لوله شماره 3 مقایسه می‌شود. متلاشی شدن لخته در لوله اول و پایداری لخته در لوله‌های دوم و سوم علامت کمبود فاکتور 13 می‌باشد. چنانچه بیمار دارای بازدارنده علیه فاکتور 13 باشد پاشیدگی لخته در لوله‌های 1 و 2 مشاهده شده در حالی که لخته در لوله سوم حداقل بمدت 24 ساعت پایدار می‌ماند.

زمان استیپون (Stypven time) یا (Russell’s viper venom test) RVVT

اصول آزمایش

سم افعی راسل فعالیت ترومبوپلاستین دارد و قادر است که مسیر مشترک انعقاد را بدون نیاز به فاکتور هفت، فعال کند. با این آزمایش می‌توان کمبود فاکتور 7 انعقادی را شناسایی کرد. در کمبود فاکتور هفت آزمایش PT طولانی ولی آزمایش RVVT نرمال می‌باشد. طولانی شدن زمان استیپون بیانگر کمبود در فاکتورهای مسیر مشترک انعقادی مانند فاکتورهای 10 یا 5 است.

زمان استیپون عبارت از زمان لازم جهت انعقاد پلاسما با افزودن سم افعی راسل بهمراه یون کلسیم و فسفولیپید پلاکتی می‌باشد.

در مسیر انعقاد داخلی و خارجی، مسیر مشترک انعقادی وجود دارد که با آزمایش RVVT ارزیابی می‌گردد.

نکته مهم:

یکی از کاربردهای مهم آزمایش RVVT در شناسایی بازدارنده لوپوس است. در حضور بازدارنده لوپوس آزمایش  RVVTطولانی شده ولی با تکرار آزمایش در مجاورت مقدار اضافی‌تر از فسفولیپید نرمال می‌شود.

سنجش عملکرد پلاکت‌ها در سیستم انعقاد خون

برای بند آمدن خونریزی نه تنها به شمارش کافی از پلاکت‌ها بلکه به کارآمد بودن پلاکت‌ها نیز نیاز است. پلاکت‌ها با چسبیدن به رشته‌های کلاژن و انقباض رشته‌های اکتین و میوزین و با تراوش کردن محتویات گرانول‌های خود و بهم چسبیدن به یکدیگر در سیستم انعقاد خون شرکت می‌کنند.

با ظاهر شدن رشته‌های کلاژن و چسبیدن پلاکت‌ها به این رشته‌ها شالوده انعقاد خون پی‌ریزی می‌شود.

آزمایش زمان سیلان (BT) و آزمایش کارآیی پلاکت‌ها با آنالیزور(platelet function analyser 100) PFA-100 عملکرد پلاکتی در حین پاره شدن مویرگ‌ها را ارزیابی می‌کنند. زمان سیلان به روش template تکرارپذیری آزمایش BT را با استاندارد کردن طول و عمق برش پوستی، تحت کنترل در می‌آورد.

پلاکت‌ها با چسبیدن به رشته‌های کلاژن و چسبیدن به یکدیگر موجب تشکیل پلاک پلاکتی در محل بریدگی گشته و خونریزی را بند می‌آورند.

                          

زمان سیلان

برای انجام آزمایش دستگاه فشار خون را با فشار mmHg40 روی بازو در تمام زمان تست ثابت نگه دارید. فشار mmHg20 برای اطفال و نوزادان رضایت‌بخش است. با تیغه مخصوص (template) برشی به ابعاد mm1 ×mm5 (mm5 طول و یک میلیمتر عمق) روی سطح ساعد حدود 3 تا 5 سانتی‌متری زیر گودی آرنج ایجاد کنید.

برش mm1 ×mm5/3 برای اطفال و mm5/0 ×mm5/2 برای نوزادان رضایت بخش است.

برش می‌تواند افقی (به موازات چین‌های گودی آرنج) یا عمودی باشد. شانس ایجاد اسکار با برش عمودی کمتر است ناحیه تولید برش بایستی عاری از خال‌کوبی، اسکار، جوش و بافت کلوئید (keloid) باشد. گفتنی است که برخی از افراد مستعد ایجاد کلوئید متعاقب زخم‌های پوستی هستند.

با مشاهده خروج خون از زخم ایجاد شده کرونومتر را به کار انداخته و قطرات خون خارج شده با کاغذ فیلتر از کناره های زخم پاک می‌شود (معمولاً هر 30 ثانیه یکبار قطرات خون از محل برش پاک می‌شود).

توجه داشته باشید که هیچگاه کاغذ فیلتر به لبه‌های زخم تماس پیدا نکند، زیرا موجب جدا شدن تجمع پلاکتی ازلبه‌های زخم و افزایش زمان سیلان می‌گردد. با رنگی نشدن کاغذ فیلتر اتمام زمان سیلان یادداشت می‌گردد.

برای آزمایش زمان سیلان دستگاه فشار خون برای افزایش فشار مویرگی بر روی بازو بسته می‌شود تا مشخص شود که آیا پلاکت‌ها می‌توانند در سیستم دینامیک و پر جنب و جوش عروقی خونریزی را بند آورند!!؟

دستگاه فشار خون را با پایان یافتن زمان سیلان برداشته و چنانچه می خواهید اطراف ناحیه برش را با پنبه الکل تمیز کنید، مواظب باشید که الکل به لبه‌های زخم تماس پیدا نکند. زیرا در غیر این صورت موجب درد شدید، خونریزی مجدد و افزایش شانس تولید اسکار می‌شود.

در پایان زمان سیلان با بانداژ کناره‌های زخم را بهم نزدیک کنید ولی دقت کنید که لبه‌های زخم روی هم قرار نگیرد. بانداژ بایستی تا 24 ساعت روی زخم باقی بماند.

با توجه به اینکه هر نمونه خون را بایستی بالقوه به عنوان یک عامل عفونی بشمار آورد از این‌رو بایستی تیغه مصرف شده در ظرف مقاوم به ابزار تیز (puncture resistant biohazard) و کاغذهای فیلتر آغشته به خون در کیسه مخصوص (biohazard bag) ریخته شود.

آزمایش زمان سیلان در تشخیص شدت بیماری فون ویلبراند و نواقص اکتسابی و ارثی پلاکتی کاربرد دارد و به طور کلی بایستی توجه کرد که به طور دقیق نمی‌توان با این آزمایش شدت خونریزی را پیش‌بینی نمود.

زمان سیلان در موارد زیر طولانی می‌شود:

1-    بیماری فون ویلبراند

2-    بیماری گلانزمن

3-    سندرم برنارد سولیر

4-    اختلال در منبع ذخیره ای پلاکت (storage pool deficiency)

5-    اورمی

6-     مایلوم مالتیپل

7-    کاهش یا فقدان فیبرینوژن

آسپرین با غیرفعال کردن آنزیم سیکلواکسیژناز برای حداقل 4 روز کارایی پلاکت در عمل تجمعی را کاهش می‌دهد.

آنتی‌بیوتیک‌های پني‌سیلین و سفالوسپورین کارایی پلاکت را تحت‌تأثیر قرار می‌دهند. هپارین و کومادین در دز دارویی اثری روی زمان سیلان ندارد.

کم‌خونی (هماتوکریت کمتر از 30%) موجب افزایش زمان سیلان می‌شود. چنانچه هر دو دست بیمار زخمی یا متورم و یا دارای تزریق محلول‌های وریدی باشد، می‌توان از ساق پا در 6 تا 8 سانتیمتری زیر زانو به عنوان محل برش استفاده کرد. در این حالت بیمار بایستی در وضعیت درازکش بوده و می‌توان دستگاه فشار خون را روی ران بست.

ارتباط مستقیمی بین زمان سیلان و کاهش شمارش پلاکتی بین 10000 تا mm3/100000 وجود دارد. توجه داشته باشید که زمان سیلان با شمارش پلاکت بیشتر یا مساوی 100000 طبیعی می‌گردد. این رابطه عبارت است از:

BT = 30 – [ plat (10)3 / 4]

برای مثال در بیماری با شمارش پلاکت /mm340000 انتظار زمان سیلان 20 دقیقه بر اساس رابطه فوق می‌باشد (20=4/40-30=BT). چنانچه زمان سیلان اندازه‌گیری‌شده کوتاهتر از حد انتظار با توجه به فرمول فوق باشد، ممکن است بیانگر حضور پلاکت‌های درشت در خون بیمار باشد که از کارآیی بیشتری برخوردارند و چنانچه زمان سیلان اندازه‌گیری شده بیشتر از زمان قابل انتظار باشد. ممکن است بیانگر اختلال کیفی پلاکت در همراهی با کاهش پلاکت‌ها باشد، که برای مثال می‌توان به سندرم ویسکوت آلدریج اشاره کرد.

 در گستره محیطی بیمار مبتلا به ترومبوسیتوپنی ایمونولوژیک (ITP ) پلاکت‌های درشت موجب موجب زمان سیلان کمتر از حد انتظار با توجه به رابطه فوق می‌گردند. برای مثال با پلاکت های 20000 انتظار زمان سیلان 25 دقیقه است ولی ممکن است اندازه‌گیری آن در آزمایشگاه زمان 10 دقیقه را نشان دهد که بیانگر حضور پلاکت های درشت و کارآمد در خون بیمار است.نمای فوق با پلاکت‌های درشت در بیماری برنارد سولیر هم مشاهده می‌شود ولی زمان سیلان اندازه‌گیری شده ممکن است بالغ بر 30 دقیقه گردد که از حد انتظار بالاتر بوده و بیانگر اختلال کیفی و کمی در پلاکت‌ها می‌باشد.

آنالیزور سنجش عملکرد پلاکتی (platelet functional analyzer) PFA-100

 آنالیزور PFA–100 به ارزیابی کارآیی پلاکت‌ها در چسبیدن به رشته‌های کلاژن و گردهمایی آنها (aggregation) در یک سیستم دینامیک (high shear) می‌پردازد و برای این منظور نمونه خون کامل سیتراته بیمار تحت فشار از یک سوراخ که اطراف آن با کلاژن و محرک‌های دیگر پلاکتی از قبیل ADP و یا اپی‌نفرین آغشته شده است، عبور داده می‌شود. زمان انسداد سوراخ بر اثر چسبیدن و تجمع پلاکتی به نام زمان انسداد (closure time) گزارش می‌گردد که بسیار شببه به زمان سیلان است.

gHghhHH

در آنالیزور PFA-100 عبور خون سیتراته از یک روزنه که اطراف آن با کلاژن یا محرک‌های پلاکتی پوشیده شده است موجب انسداد سوراخ به علت

چسبیدن و تجمع پلاکتی می‌گردد. آنالیزور PFA-100شبیه به آزمایش BT بازسازی شده است.