شناسایی كريپتوكوكوس نئوفرمنس

دكتر محمد قهری – آزمایشگاه تشخیص طبی رسال

((دستورالعمل اجرائی آزمایش مایع مغزی نخاعی برای جدا كردن و شناسائی عوامل قارچی با تأكید بر كریپتوكوكوس نئوفرمنس))

علائم عمومی مننژیت‌های قارچی

مایع مغزی نخاعی (CSF) در این بیماران، معمولاً دارای منظره‌ ی شفاف است. سطح پروتئین عموماً افزایش یافته است و ممكن است بیشتر از یك گرم در لیتر باشد. قند آن معمولاً پائین است. تعداد سلول‌ها در هر میلی‌متر مكعب افزایش متوسطی دارد (از چندین عدد تا چند صد عدد).

آزمایش مستقیم میكروسكپی
حداقل 10 میلی‌لیتر از مایع CSF را سانتریفیوژ كرده و رسوب آن را مورد آزمایش مستقیم میكروسكوپی و كشت قرار می‌دهند. گسترش مرطوب شامل آزمایش مستقیم یك قطره از رسوب، تهیه لام با مركب چین و رنگ‌آمیزی‌ها شامل متیلن‌بلو، گرم، كالكوفلوروایت، گیمسا، گوموری متنامین سیلور و PAS می‌باشد.

كریپتوكوكوس نئوفرمنس مخمرهای كپسول‌دار هستند  5 تا 10 میكرون و با كپسول 20 تا 30 میكرون قطر. درمننژیت كریپتوكوكوسی عموماً منونوكلئرها غلبه دارند و مننژیت مزمن لنفوسیتیك ایجاد می‌كنند. مخمرهای جوانه‌دار كوچك (3 تا 5 میكرون) به ویژه اگر همراه با هایفی یا سودوهایفی دیده شود دلالت بر كاندیدا می‌كند.مننژیت حاد یا نوتروفیلیك غالباً در مننژیت كاندیدائی دیده می‌شود. باید توجه داشت كه كاندیدا گلابراتا فقط شامل بلاستوكونیدی (2.5 تا 4.5 میكرون) است. اندازه‌ی سلول‌های‌ مخمری هیستوپلاسما كپسولاتوم كوچكتر (2 تا 4 میكرون) است. سلول‌های بلاستومایسس درماتیتیدیس بزرگتر (8 تا 15 الی 30 میكرون) می‌باشند. در مننژیت ناشی از بلاستومایسس درماتیدیس پلی مرفونوكلئرها غلبه دارند. هیستوپلاسما و بلاستومایسس در بافت معمولاً هایفی ندارند. در مننژیت قارچ‌های رشته‌ای نوتروفیل‌ها غلبه دارند. قارچ‌های رشته‌ای بیشتر موجب گرانولوما یا آبسه‌ی مغزی می‌شوند تا مننژیت. در مننژیت ناشی از كوكسیدیوئیدس ایمیتیس ائوزینوفیل‌ها حضور دارند ومننژیت گرانولوماتوزی ایجاد می‌كند.

عوامل قارچی ایجادكننده مننژیت: كریپتوكوكوس نئوفرمنس، كریپتوكوكوس گتی، گونه‌های كاندیدا، گونه‌های آسپرژیلوس، كوكسیدیوئیدس ایمیتیس، بلاستومایسس درماتیتیدیس، هیستوپلاسما كپسولاتم، اسپوروتریكس شنكئی، پاراكوكسیدیوئیدس برازیلینسیس و پنی‌سیلیوم مارنفئی و علل قارچی نادر شامل كلادوفیالوفورا بانتیانا، موكور و رودوترولا می‌باشند.
علل زمینه‌ای: پیوند ارگان، شیمی درمانی سرطان، بستری بودن در ICU، بیماران دارای اختلالات سیستم ایمنی، سركوبی سیستم ایمنی، بدخیمی‌های خونی (لوسمی، لنفوم)، درمان‌های كورتیكوستروئیدی، بیماری‌های التهابی (ساركوئیدوز)، نوزادان نارس، بیماران HIV مثبت.  

كریپتوكوكوس نئوفرمنس

مایع نخاع، شفاف و به ندرت زرد رنگ یا كدر است. تعداد لكوسیت‌ها افزایش دارد، ولی معمولاً از 800 سلول تجاوز نمی‌كند. تعداد لنفوسیت‌ها اغلب بالا است، اما گاهی نوتروفیل‌ها هم زیاد می‌شوند. پروتئین بین 40 تا 600 میلی‌گرم درصد متغیر است. میزان قند پائین است (اغلب حدود 10 میلی‌گرم درصد).
آزمایش میكروسكپی با پتاس 10%، رنگ‌آمیزی با گیمسا و استفاده از روش اختصاصی مركب چین (مخمرهای گرد به قطر 5 تا 20 میكرون، اتصال نقطه‌ای جوانه به سلول مادر، كپسول ضخیم ژلاتینی) برای تشخیص ارگانیسم صورت می‌گیرد. بجز گونه‌های غیرعادی كلیه مخمرهای جنس كریپتوكوكوس مخمرهائی بدون رشته، كپسول‌دار و بدون رنگدانه كاروتنوئید هستند. انواع كریپتوكوكوس‌ها اوره‌آز مثبت هستند و در محیط حاوی اوره با ایجاد كربنات آمونیوم (قلیائی) رنگ محیط را بعد از چهار روز قرمز می‌كنند. كریپتوكوكوس‌ها عمدتاً هیچیك از قندها را تخمیر نمی‌كنند. حساسیت آنها در مقابل اكتیدیون متغیر است. (بطور كلی 0.1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر از رشد كریپتوكوكوس در محیط كشت جلوگیری می‌كند). همچنین تولید آنزیم فنل اكسیداز می‌كنند.

تشخیص آزمایشگاهی مننژیت كریپتوكوكوسی در بیماران ایدزی

تعداد زیاد ارگانیسم در CSF این بیماران موجب مثبت شدن آزمایش مستقیم میكروسكپی با مركب چین می‌شود (70 تا 90% موارد نتیجه مثبت است). توضیح اینكه درآزمایش مركب چین هنگامی كه تعداد سلول در هر میلی‌لیتر بین 1000 تا 10.000 باشد، نتیجه مثبت خواهد بود. در بیماران ایدزی این میزان برابر 100.000 الی 10.000.000 سلول است. لكوسیت‌ها، قطرات چربی، سلول‌های بافتی و گلبول‌های میلین ممكن است با اشتباه گرفتن با عناصر مخمری موجب نتیجه مثبت كاذب در آزمایش مركب چین گردند. سانتریفیوژ كردن نمونه با دور 500 در دقیقه به مدت 10 دقیقه حساسیت این تست را افزایش می‌دهد. (casadevall, 1998). تعداد گلبول‌های سفید كاهش دارد و یا ممكن است نرمال باشد.

تشخیص آزمایشگاهی مننژیت كریپتوكوكوسی در بیماران غیرایدزی
آزمایش مركب چین تقریباً در 50% بیماران مثبت است. تعداد گلبول‌های سفید مایع نخاع افزایش نشان می‌دهد و اكثراً از نوع لنفوسیتی هستند.

كشت
معمولاً در مدت 48 تا 72 ساعت رشد می‌كند. دمای مطلوب برای رشد آن 30 تا 35 درجه است. هرچند كه در 37 درجه سانتی‌گراد نیز رشد می‌كند. (سابورو دكستروز آگار محتوی كلرامفنیكل، محیط خوندار و BHI). در مقابل حرارت بسیار حساس است و در دمای 40 تا 42 درجه رشد نمی‌كند. كلنی‌های سفید خامه‌ای با هاله‌ای صورتی ظاهر می‌شود كه بعد از 5 تا 8 روز سطح كلنی‌ها صاف، مرطوب و موكوئیدی شده و به رنگ گل اخرا در می‌آیند. كشت از حجم زیاد CSF و تكرار نمونه‌گیری می‌تواند كمك‌كننده باشد. محیط كشت اختصاصی birdseed agar است كه محتوی تركیبات دی‌فنولیك بوده و Cryptococcal laccase موجب تشكیل ملانین و در نتیجه ظهور كلنی‌های قهوه‌ای رنگ می‌شود.
از محیط كشت اختصاصی Concanavine-glycin thymol blue agar برای تشخیص افتراقی كریپتوكوكوس نئوفرمنس از كریپتوكوكوس گتی استفاده می‌شود. (زمان انكوباسیون این محیط 5 روز در دمای 30 درجه می‌باشد). در این محیط، كریپتوكوكوس گتی رنگ سبز محیط كشت را به رنگ آبی تبدیل می‌كند. باید توجه داشت كه مخمرهای دیگری نظیر كریپتوكوكوس لورنتی (C. laurentii) و تریكوسپورون موكوئیدس نیز می‌توانند موجب تغییر رنگ این محیـــــــــــــط كشت شوند (CGB- positive)، اما هردو این مخمرها از نظر تولید ملانین منفی هستند. بنابراین تست CGB فقط برای تشخیص افتراقی كریپتوكوكوس گتی از كریپتوكوكوس نئوفرمنس مفید است. در یك مطالعه از 149 بیمار HIV منفی مبتلا به مننژیت 89% آنها كشت مثبت داشته اند. (pappas, 2001) در بیماران ایدزی این میزان برابر 95 تا 100% بوده است. (zugen, 1986 & Kovacs, 1985). آزمایش مستقیم و كشت اختصاصی هستند، ولی دارای میزان حساسیت برابر با 50 تا 80 درصد می‌باشند.

سرولوژی
اندازه‌گیری آنتی‌بادی سودمند نیست. اندازه‌گیری آنتی‌ژن كریپتوكوكال، تست سریع و ساده‌ای است. آزمایش آگلوتیناسیون لاتكس و الایزا دارای حساسیت بیش از 90% (در بعضی گزارش‌ها حساسیت آگلوتیناسیون لاتكس 85% و حساسیت الایزا را حدود 80% ذكر كرده‌اند) و تیتر بیشتر از یك چهارم (1/4) بسیار اختصاصی است. تیتر مساوی یا بیشتر از 1/8 نشان‌دهنده‌ی عفونت فعال است. در بیماران HIV مثبت بدون علامت، با كمك این تست می‌توان تشخیص سریع و زودرس انجام داد.
چند نمونه از تحقیقاتی كه در آنها حساسیت آزمایش آگلوتیناسیون لاتكس مطالعه شده است:
در 16 مورد مننژیت كریپتوكوكی     (kovacs, 1985)     100%
در 26 مورد مننژیت كریپتوكوكی     (zugen, 1980)        92%
در 88 مورد مننژیت كریپتوكوكی     (chuck, 1989)        91%
در 40 مورد مننژیت كریپتوكوكی      (clark, 1990)         92.5%
در افراد HIV منفی: در سایر بیماران بویژه افراد دارای ایمنی شایسته،  كشت و آزمایش آنتی‌ژن CSF گاهی اوقات منفی و در نتیجه تشخیص مشكل است.

علل بروز واكنش مثبت كاذب در تست آگلوتیناسیون لاتكس
– فاكتور روماتوئید
– كانسر (بسیار ضعیف)
– عفونت مربوط به تریكوسپورون (آنتی‌ژن پلی‌ساكاریدی كپسولی شبیه كریپتوكوك تولید می‌كند)
– عفونت مربوط به  Stomatococcus mucilaginosis(آنتی‌ژن كپسولی تولید می‌كند كه واكنش متقاطع با كپسول كریپتوكوك می‌دهد)
– عفونت با Capnocytophaga canimorsus
– آلودگی با ابزارهای آزمایشگاهی (during pippeting )
– آلودگی به هنگام استفاده از مواد ضدعفونی كننده و صابون برای تمیز كردن اسلایدها، آلودگی با آگار و آگارز
برای جلوگیری از واكنش‌های ناخواسته نمونه‌ها باید با آنزیم‌های پروتئولیتیك مانند پروناز آماده‌سازی شوند و با 2- بتا مركاپتواتانول یا دی تیوتریتول احیاء شوند.
واكنش‌های منفی كاذب ممكن است بعلت اثر پروزون، عفونت با یك استرین با كپسول بسیار ضعیف، بار پائین ارگانیسم در نمونه و یا مشكلات مربوط به كیت دیده شوند.

مننژیت آسپرژیلوسی
از طریق دستگاه تنفس و سینوس‌های اطراف بینی وارد بدن می‌شود. تهاجم به سیستم اعصاب مركزی بوسیله‌ی تلقیح مستقیم به نواحی كه به لحاظ آناتومیك نزدیك مغز هستند و یا بوسیله‌ی انتشار هماتوژنوس صورت می‌گیرد. علاوه بر عفونت اولیه در ریه‌ها، انتشار خونی بوسیله‌ی تلقیح مستقیم به داخل جریان خون از طریق گوش میانی، سینوس‌های اطراف بینی، چشم و ماستوئید و یا در نتیجه‌ی عمل جراحی قلب باز اتفاق می‌افتد. آسپرژیلوس فومیگاتوس و آسپرژیلوس فلاووس از عوامل شایع هستند. آسپرژیلوس ترئوس اگرچه یك عامل غیرمعمول تهاجم به سیستم اعصاب مركزی است، اما به لحاظ مقاومت به آمفوتریسین B دارای اهمیت است و مرگ‌ و‌ میر بالائی دارد.

اقدامات آزمایشگاهی
آماده‌سازی نمونه: نمونه CSF به مدت 10 دقیقه با دور 10000 سانتریفیوژ شود.
رسوب: برای آزمایش میكروسكپی از روش رنگ‌آمیزی گرم و متیلن بلو و كالكوفلور وایت استفاده شود.
كشت: در محیط سابورو دكستروز آگار محتوی 10% كلرامفنیكل و آبگوشت سابورو تلقیح شده و محیط آبگوشتی را در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 هفته نگهداری می‌نمایند. كشت‌های مثبت هنگامی بدست می‌آیند كه حجم زیادی از نمونه به محیط كشت تلقیح شود (ترجیحاً 5 میلی‌لیتر و بیشتر).
سرولوژی: اندازه‌گیری آنتی‌ژن اختصاصی آسپرژیلوس (گالاكتومانان) در سرم و مایع مغزی- نخاعی توسط ساندویچ الایزا به تشخیص كمك می‌كند.

نحوه انجام آزمایش بر روی نمونه CSF از نظر عوامل قارچی (با تأكید بر كریپتوكوكوس نئوفرمنس)

توجه: تا قبل از انجام كشت نمونه نباید در یخچال قرار گیرد، زیرا استرین‌های كریپتوكوكوس نسبت به دمای پائین حساس بوده و از بین می‌روند.
– ابتدا نام و مشخصات بیمار به دقت ثبت شود.
– حجم نمونه اندازه‌گیری و ثبت شود.
– رنگ و میزان شفافیت یا كدورت نمونه بدقت ثبت شود.
– تمام نمونه بمدت 15 دقیقه با دور 1000 سانتریفوژ شود.
– مایع روئی به لوله استریل دیگری برای انجام تست‌های سرولوژیك منتقل شود.
از رسوب نمونه (pellet) آزمایش مستقیم میكروسكپی و كشت انجام می‌شود. ابتدا رسوب را خوب به هم زده تا مخلوط همسانی بدست آید، سپس:

الف- آزمایش‌های میكروسكوپی از رسوب

آزمایش مستقیم میكروسكوپی
هدف: بررسی وجود یا فقدان عناصر قارچی (هایفی كاذب و مخمرهای جوانه‌دار) و آمیب‌های آزادزی(Amphizoic Amoeba)مانند نگلریا و آكانتاموبا.
روش كار: تهیه لام مرطوب بصورت مستقیم با برداشت یك قطره از رسوبی كه خوب مخلوط شده‌ است و قرار دادن آن روی لام و مشاهده میكروسكپی با عدسی 10 و 40. وضعیت گلبول‌های قرمز و سفید نیز در این آزمایش از نظر فراوانی در نظر گرفته می‌شود.
تهیه لام با مركب چین :  یک قطره از رسوب CSF را روی لام قرار داده و به آن یك قطره مركب چین (كه حجم آن یك سوم حجم قطره‌ی برداشت شده از مایع CSF باشد) افزوده و بعد از مخلوط كردن با عدسی 10 و 40 بررسی می‌كنیم. در صورت وجود سلول‌های مخمری كپسول‌دار اطراف این سلول‌ها، هاله‌ی ضخیم و شفافی دیده می‌شود و با عدسی 10 منظره شبیه آسمان سیاه پرستاره مشاهده می‌گردد. برخی از استرین‌های كریپتوكوك، فاقد كپسول و یا برخی ممكن است دارای كپسول ظریفی باشند. مخمرهای كپسول‌دار در CSF حدود 60درصد بیماران مبتلا دیده می‌شود. حساسیت این آزمایش را از 60% تا 72% گزارش كرده‌اند.

توجه برای تهیه لام جهت رنگ‌آمیزی‌های زیر ابتدا لام را به صورت زیر تهیه كنید:

یك قطره درشت از رسوب را روی لام قرار داده و بدون اینكه آن را پهن كرده یا بگسترانید اجازه دهید در مجاورت هوا خشك شود. بعد از خشك شدن یك قطره‌ی دیگر به همین شكل روی قطره‌ی خشك شده ریخته و مجدداً اجازه دهید تا در مجاورت هوا خشك شود. سپس لام را با كمك حرارت مختصر و یا بكمك متانول فیكس نموده و رنگ‌آمیزی‌های زیر را انجام دهید. (به اینصورت یك گسترش نسبتاً ضخیم و پرسلول حاصل خواهد شد كه مشاهده و بررسی میكروسكپی آن سریع‌تر و دقیق‌تر خواهد گردید).

رنگ‌آمیزی گیمسا یا رایت گیمسا: از همان دستورالعمل رنگ‌آمیزی برای هماتولوژی استفاده می‌شود. هدف بررسی وضعیت گلبول‌های سفید از نظر برتری حضور منونوكلئرها یا پلی‌نوكلئرها و نیز مشاهده احتمالی سلول‌های مخمری می‌باشد.

رنگ‌آمیزی گرم: هدف بررسی وجود احتمالی عناصر باكتریال و نیز سلول‌های مخمری می‌باشد.
گسترش از خلط بیمار مبتلا به لنفوم، رنگ‌آمیزی گرم: سلول‌های مخمری كریپتوكوكوس نئوفرمنس و كوكسی‌های گرم منفی موراكسلا كاتارالیس می‌باشند.

رنگ‌آمیزی كانیون: برای بررسی وجود احتمالی باكتری‌های رشته‌ای نظیر نوكاردیا می‌باشد.

ب- كشت از رسوب در محیط‌های زیر انجام گیرد:

سابورودكستروز آگار، سابورو كلرآمفنیكل‌دار، BHI و انكوباسیون در دمای آزمایشگاه یا 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 تا 5 روز

محیط ژلوز خوندار و انكوباسیون در 37 درجه سانتی‌گراد و محیط ژلوز شكلاتی و انكوباسیون در شرایط 5 تا 10 درصد گاز كربونیك و 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 تا 5 روز

محیط كشت  Lowenstein-Jensen: كشت از نظر AFB در هر نمونه باید صورت گیرد. این كشت‌ها تا یكماه باید در شرایط 37 درجه سانتی‌گراد نگهداری شوند.

توضیحات:

میزان حساسیت كشت را حدود 56% گزارش می‌كنند. كشت حجم زیادی از نمونه و در بعضی موارد، كشت نمونه‌های متعدد حساسیت كشت را افزایش می‌دهد.

پلیت‌های حاوی محیط‌های كشت فوق را باید روزانه از نظر رشد بررسی و تا 3 هفته نگهداری كرده و در صورت عدم رشد بعد از 3 هفته منفی تلقی نمود. رشد هرگونه كلنی با رنگ‌آمیزی گرم مورد بررسی قرار گیرد و در صورت مشاهده سلول‌های مخمری رنگ‌آمیزی كپسول (مركب چین و یا رنگ نیگروزین10%) انجام شود.

كریپتوكوكوس نئوفرمنس معمولاً ظرف 2 تا 3 روز بصورت كلنی‌های كرم رنگ سفید تا زرد مایل به قهوه‌ای ظاهر می‌شوند. استرین‌های كپسول‌دار كلنی‌های براق و درخشانی را ایجاد می‌كنند و استرین‌هائی كه فاقد كپسول بوده یا كپسول ضعیفی دارند، خشك به نظر می‌رسند.

ممكن است بعد از 24 الی 48 ساعت كلنی‌های سفید خامه‌ای با هاله‌ی صورتی ظاهر شوند كه بعد از 5 تا 8 روز بصورت كلنی‌های صاف، مرطوب و موكوئیدی به نظر برسند. در محیط سابورو مالتوز آگار كلنی‌ها رنگ گل اخرا به خود می‌گیرند.

در محیط EMB بعد از یك هفته بصورت مرطوب و سیال در می‌آیند.

در صورت رشد كلنی‌های مخمری مشكوك به كریپتوكوكوس نئوفرمنس به منظور تأئید حداقل می‌توان از تست‌های زیر كمك گرفت:

– تست هیدرولیز اوره در محیط chrisensen’s urea agar (نتیجه مثبت است)

– تست احیاء نیترات (نتیجه منفی است)

– تست فنل اكسیداز (نتیجه مثبت است)

با توجه به اینكه رنگ‌آمیزی‌های گرم و گیمسا بیشتر متداول می‌باشند در اینجا فقط به شرح جزئیات روش رنگ‌آمیزی كانیون بسنده می‌شود:

روش رنگ‌آمیزی كانیون (زیل نلسون اصلاح شده)

هدف: برای رنگ‌آمیزی باكتری‌های اسیدفست مانند مایكوباكتریوم‌ها و نیز باكتری‌های اسیدفست نسبی یا اسیدفست ضعیف مانند نوكاردیاها می‌باشد.

نكته: استفاده از رنگ كربول فوشین (carbolfuchsin)  در این رنگ‌آمیزی به دلیل اینكه دارای غلظت بیشتری از فنل و فوشین بازیك است، نیازی به حرارت دادن (مانند زیل نلسون كلاسیك) ندارد.

روش رنگ‌آمیزی

1-    رنگ كانیون كربول فوشین را روی لام بریزید و 5 دقیقه صبر نمائید.

2-    شستشوی كامل با آب

3-    اسید الكل (اسیدكلریدریك 3% در اتانول) به مدت 3 دقیقه روی لام قرار دهید.

4-    شستشوی كامل با آب

5-    رنگ متیلن بلو به مدت 3 دقیقه روی لام بماند.

6-     شستشوی كامل با آب

7-    لام را خشك كرده و با عدسی روغنی میكروسكوپ مشاهده كنید.

نكته 1- اسیدكلریدریك 3% كه در محلول اسید الكل وجود دارد برای مایكوباكتریوم‌ها مناسب است. اگر هدف بررسی و مشاهده نوكاردیاها باشد بهتر است در تركیب اسید الكل به عوض اسیدكلریدریك از اسید سولفوریك 1% استفاده شود.

نكته 2- در این رنگ‌آمیزی باكتری‌های اسیدفست قرمز و باكتری‌های غیراسیدفست آبی رنگ می‌گیرند.

منابع مورد استفاده

1- Diagnostic Bacteriology: A study guide, Margaret A, Bartelt 2000, F. A. Davis Company

2- Saha, D.C , Xess I. , Jain N. Evaluation of conventional and serological methods for rapid diagnosis of cryptococcosis. Indian J Med Res 127, 2008, pp:483-88.

3- www.doctorfungus.org/mycoses/human/crypto/crypto_index.php