آزمایش NIPT (سل فری)

روش ملکولی غیر تهاجمی برای تشخیص تریزومی های ۲۱، ۱۸ و ۱۳

در سال ۱۹۹۷ دانشمندان به وجود DNA جنین در خون زنان بارداری پی بردند. این کشف مهم که با ردیابی قسمت هایی از کروموزوم Y جنین در سرم مادر توسط Dennis Lo صورت گرفت. این موضوع اساسی  برای ظهور روش های غیر تهاجمی تشخیص آنوپلوئیدی ها در دوران بارداری شد. اصول این روش بر پایه اندازه گیری DNA آزاد در پلاسمای مادر است که از سلول های جفت آزاد می شوند. صاحب نظران این کشف را انقلابی در علوم پره ناتولوژی دانسته و پیش بینی می کنند. در آینده نزدیک تست های مبتنی بر آن، جایگزین روش های رایج غربالگری و آزمایش های تشخیصی دوران بارداری گردد.

به طول کلی تمرکز برنامه های غربالگری دوران بارداری بر روی تشخیص سندروم داون و دو آنوپلوئیدی اتوزومال دیگر که کمتر شایع هستند، یعنی تریزومی ۱۸ (سندروم ادوارد) و تریزومی ۱۳ (سندروم Patau) است. سندروم داون یا تریزومی ۲۱ شایع ترین آنوپلوئید در انسان با شیوع تقریباً ۱ در ۸۰۰ است. ریسک ابتلا جنین به سندروم داون با افزایش سن بالا می رود طوری که یک زن ۴۵ ساله ریسک ۱ به ۳۵ دارد. در حال حاضر پیشرفت هایی در درمان اکثر بیماران مبتلا به سندروم انجام گرفته است. به طوری که افراد با سندروم داون تا سنین بالا (تقریباً ۵۵ سالگی) می توانند زندگی کنند.

پیشرفت‌های غربالگری تریزومی‌ها؛ از روش‌های سنتی تا توالی‌یابی موازی عظیم (MPS)

تریزومی های ۱۸ و ۱۳ نیز همانند سندروم داون در سه ماهه اول و دوم شایع تر از موقع زایمان بوده است و به میزان بالایی سقط خود به خودی پیش می آید. مبتلایان به تریزومی ۱۸ و 13عمر کوتاه تری دارند و ۵ تا ۱۰ درصد از آن ها تا یک سالگی زنده می مانند. در بیست سال گذشته روش های گوناگونی مانند اندازه گیری مارکرهای شیمیایی و پارامترهای سونوگرافی و ترکیب این دو روش با هم برای غربالگری سندروم داون به کار می رود. به دلیل مشکلات این روش ها دانشمندان همیشه به دنبال روش های بهتری بوده اند.

بیشترین اشکال روش های سنتی غربالگری درصد بالای نتایج مثبت و منفی کاذب است که در تست های تائیدی احتمال سقط جنین به علت تهاجمی بودن روش نمونه گیری است. از دیگر نکات منفی روش های غربالگری رایج می توان به چند مرحله ای بودن پروسه آزمایش، نتایج غیر اختصاصی و گاهی گیج کننده و غیر قابل تصمیم گیری و در نتیجه افزایش خطر استفاده از روش های تهاجمی اشاره کرد.

بالاخره موفقیت واقعی در سال ۲۰۰۸ به دست آمد. هنگامی که دو گروه جدا از هم از محققان با کار بر روی جمعیتی ۱۸ و ۱۴ تایی از جنین های مبتلا به آنوپلوئیدی، قدرت تشخیص تریزومی های جنین را با کمک تکنیکMasively Parallel Sequencing   با درستی ۱۰۰ درصد ثابت شد.

تکنیک آزمایش فری سل

این تکنیک به نحوی است که در ابتدا  500bp از فراگمنت های DNA جنین در خون مادر تعیین توالی می شود. بعد از آن با کمک محاسبات و نقشه برداری بیوانفورماتیک تعداد کروموزوم های جنین محاسبه می شود. نیمه عمر این DNA بسیار کوتاه است و در کمتر از دو ساعت از بین می رود و بلافاصله بعد از تولد از خون مادر محو می شود. به همین دلیل سابقه بارداری های قبلی اختلالی در این تست ندارد. برای جلوگیری از کاهش میزان DNA برای انجام این آزمایش، خون مادر در لوله های حاوی ماده مخصوصی گرفته می شود که مقدار DNA موجود در خون مادر را ثابت نگاه دارد.

مطالعات پرجمعیت تری اخیراً گزارش شده است که میزان تشخیص این روش برای تریزومی ۲۱ به مقدار ۹۹.۹ درصد و با خصوصیت ۹۹.۷ تا ۹۹.۹ درصد حتی در مورد دوقلوها نشان می دهد. در این آزمایش جنسیت جنین و همچنین آنوپلوئیدی های کروموزوم های جنسی مانند سندروم ترنر نیز از هفته دهم قابل تشخیص است. در این روش بدون نیاز به سلول های بافت جفت(CVS) یا نمونه گیری از مایع آمنیوتیک ( همان آمنیوسنتز )، از چند میلی لیتر خون وریدی مادر استفاده می شود. علاوه بر این که در یک تست همزمان تریزومی های ۲۱ و ۱۸ و ۱۳ با حساسیت بیشتر از ۹۹.۹ درصد بررسی می شوند، درصد موارد مثبت و منفی کاذب به میزان کمتر از ۱ درصد کاسته می شود.

باید توجه داشت که انجام این آزمایش نیاز به آزمایش AFP را جهت بررسی نقص لوله عصبی NTDs در سه ماهه دوم از بین نمی برد و افراد باردار باید در هفته های پانزدهم تا بیستم مجدداً به آزمایشگاه مراجعه کنند.

هنوز در مورد کسانی که نتیجه تست Cell Free DNA آن ها مثبت است (پر خطر) باید تست تائیدی همانند CVS یا آمنیوسنتز را انجام دهند. نسبت درصد مثبت کاذب بسیار پایین است، بنابراین تعداد افرادی که باید حتماً آزمایشات تائیدی را انجام دهند، بسیار پایین است.

با آزمایش Cell free DNA می توان جنسیت جنین را از ده هفتگی تشخیص داد.

برای آگاهی بیشتر با ارقام مورد بحث لازم است فرض کنیم که تمامی موارد بارداری در ایران سالیانه ۱ میلیون و ۳۰۰ هزار مورد باشد. در صورت انجام غربالگری با روش نوین NIPT منافع زیر را می توان به دست آورد.

• در روش متداول تعدادس بیمارانی که با نتیجه مثبت کاذب برای انجام تست تائیدی آمنیوسنتز معرفی می شوند تقریباً ۶۵۰۰ نفر است. با روش NIPT تنها ۴۴۲ نفرد خواهد بود. به این معنا که سالیانه بیش از ۶۴۵۰۰ مورد انجام روش آمنیوسنتز کمتر درخواست می گردد.
• تعداد موارد سقط جنین به دلیل ارجاع برای نمونه گیری تهاجمی در روش نخست حدوداً ۲۰۰ و در روش نوین تنها ۱۳ مورد است.
• مورد منفی کاذب در روش غربالگری کلاسیک یا سنتی حدوداً ۳۲۵ مورد است. اما در روش نوین ۱ یا ۲ مورد خواهد بود، یعنی ۳۲۳ بیمار کمتر در یک سال.

مقایسه روش های غربالگری سندرم داون
روش	قدرت تشخیص	مثبت کاذب	سن بارداری	ماهیت روش
غربالگری با استفاده از مارکرهای شیمیایی خون مادر	90% – 70%	5%	13 – 11 20 – 15	غیر تهاجمی
سونوگرافی NT	80% – 60%	5%	13 – 11	غیر تهاجمی
CVS	99%<	0	13 – 10	تهاجمی
آمنیوسنتز	99%<	0	21 – 16	تهاجمی
Cell Free DNA	99.9%<	0.034%	24 – 10	غیر تهاجمی

مزایای تست

غیر تهاجمی بودن: برای انجام تست تنها به چند میلی لیتر از خون مادر نیاز است.

حساسیت و دقت تشخیص بالا: مطالعه روی تعداد نفرات زیادی انجام شده است. خصوصیت و حساسیت ۹۹.۹ درصد دیده شده است.

تشخیص زود هنگام : آزمایش از هفته دهم بارداری قابل انجام بوده و این به تصمیم گیری مناسب تر کمک خواهد کرد.

اگرچه تا سال ۲۰۱۳ آزمایش و تحقیقات درباره مفید بودن این آزمایش در مورد بارداری های پر ریسک انجام گرفته است. اما در سال ۲۰۱۴ دو مرکز معتبر به نام های کالج ژنتیک پزشکی آمریکا (ACMG) و کالج سلطنتی بیماری های زنان و زایمان (RCOG) و همچنین پروفسور KyprosNicolaides کاربرد تست NIPT را به عنوان یک تست غربالگری با حساسیت بالا پیشنهاد کردند.

زمان جوابدهی: نتیجه این تست طی دو هفته پس از نمونه گیری در دسترس است. در مقایسه با روش آمنیوسنتز یا CVS که تقریباً بین سه تا چهار هفته زمان می برد، سریع تر است.

موارد کاربرد

به عنوان یک تست مرحله دوم برای کسانی که دارای نتیجه پر خطر در روش های غربالگری متداول هستند، برای کاهش تعداد آمنیوسنتز و در نتیجه کاهش خطر سقط جنین به کار می رود.

یه عنوان یک آزمایش غربالگری با قدرت تشخیص بالا برای افرادی که تمایل ندارند میزان ریسک منفی کاذب داشته باشند. در روش های متداول غربالگری این ریسک منفی کاذب وجود دارد. یک انتخاب است برای افرادی که قادر به پذیرش خطر روش های تهاجمی نیستند. یا از انجام نمونه گیری در روش های تهاجمی ترس دارند. همچنین انتخابی است برای مواردی که کشت سلولی موفقیت آمیز نیست.

تحول در غربالگری پیش از تولد با استفاده از DNA آزاد جنینی

صاحب نظران کشف وجود DNA جنین در خون مادر را یک انقلاب در علوم تشخیصی می دانند و امیدوارند که در آینده نزدیک روش های مبتنی بر اندازه گیری این DNA جایگزین تست های رایج غربالگری گردد. در روش تهاجمی علاوه بر احتمال سقط جنین ( دو تا چهار درصد ) فشار روحی قابل توجه، دردناک بودن روش نمونه گیری و ریسک عفونت های داخل رحمی نیز قابل ذکر می باشند. اصولاً انتخاب بین تست های سنتی غربالگری که در آن احتمال خطا بالاست و آمنیوسنتر یا CVS که احتمال سقط جنین را به همراه دارند برای زنان باردار کار دشواری است.

همچنین از نظر زمانی نیز انجام روش های غربالگری که در سه ماهه دوم بارداری امکان پذیر می باشد. محدودیت های زمانی را نیز برای تصمیم گیری در مورد سقط جنین قانونی یا نگهداشتن جنین به همراه دارد. علاوه بر آن در بسیاری از موارد در صورت مثبت یا مشکوک بودن تست غربالگری در سه ماهه اول، بیمار مجبور به انجام تست تائیدی در سه ماهه دوم خواهد بود و در طول این مدت تا انجام و دریافت نتیجه آزمایش دچار استرس و نگرانی می شود.

پیشنهادات:

• خانم های باردار باید قبل از تصمیم گیری در مورد انتخاب روش مورد استفده برای غربالگری و با تائید نتیجه مثبت (پر خطر) در روش های رایج غربالگری مورد مشاوره قرار گرفته و از مزایا و معایب همه روش های موجود مطلع گردند.
• یکی از کاربردهای این تست برای کسانی است که از نحوه نمونه گیری روش های تهاجمی وحشت دارند.
• انجام تست NIPT برای زنانی که نمی توانند خطر سقط در روش های تهاجمی را بپذیرند مانند زنانی که پس از درمان های طولانی و پر هزینه و یا در سنین بالا باردار شده اند.