مدیریت امضاء -13
ادامه از شماره قبل
– آقای دكتر؛ از توضیحات شما متشكریم. اینطور كه پیداست چند نكته دیگر در مورد هاپتن‌ها یادداشت كرده‌اید كه هنوز توضیح نداده‌اید.
– بله اگر اجازه بفرمائید؛ و اگر سؤالات فرعی شما فرصت بدهد!
نكته دوم در مورد هاپتن‌ها و سنجش آنها در آزمایشگاه این است كه چنانچه آنها را به روش‌های الایزا یا با گاماكانتر بسنجیم كه روش‌های رایج روز در ایران هستند …
– یا حتی به روش كمولومینانس كه الان خیلی فراگیر شده است …
– بفرمائید كمی لومینسانس.
– كمی‌‌لومی‌‌سانس.
– نخیر. كمیلومینسانس … یا بگوئید ”شیم‌افروزی” و خودتان را راحت كنید.
– شیم افروزی؟
– بله. ساده شده اسم ”فروزندگی شیمیائی” است. كلمه لومینسنس Luminescence (یا به سیاق فرانسوی‌ها: لومینسانس) به معنی تابش و نورتابی است یا فروزش. به طور كلی این نوع نورتابی به صور مختلف پدیدار میشود كه گاهی اساس بیولوژیك دارد مثل تابش از طریق شبه‌لومینول‌ها و لوسیفرین‌های كرم شب‌تاب و برخی باكتری‌ها كه به بیولومینسانس معروف است و برای سادگی تلفظ خوب است معادل فارسی آن را بگوئیم كه ”زیست افروزی” است و گاهی نیز اساس غیربیولوژیك دارد كه به لومینسانس شیمیائی یا Chemiluminescence معروف شده است هر چند كه در هر دو دسته واكنش، نور از مواد شیمیایی ساتع میشود.
– این تعریف مربوط به فلوئورسانس نیست؟
– خیر. اگر بخواهم واضح‌تر بگویم اساس ” فروزندگی” با فلوئورسانس كاملاً متفاوت است. حتی با فسفرسانس هم متفاوت است.
در زیست افروزی در گروه اول، این واكنش‌های شیمیایی در بدن موجود زنده است و معمولا ً‌یك آنزیم حیاتی، كاتالیزور آن است در حالی كه واكنش‌های گروه دوم را مثلاً در لوله آزمایش و با وارد كردن مولكول‌های اكسیدان به جمع واكنشگر‌ها هدایت می‌كنیم.
پس متوجه می‌شوید كه در هر دو نوع Luminescence یا فروزندگی، پیدایش نور از یك مولكول به واسطه فعل و انفعالاتی شیمیایی است كه مستقیماً در خود آن مولكول رخ میدهد مثلاً به دلیل جابجایی سریع الكترون‌ها در پیوند‌های دوگانه آن مولكول؛ در حالی كه در پدیده‌های فلوئورسانس، یك منبع انرژی از خارج ( و معمولاً یك منبع فیزیكی نه شیمیائی مثل اشعه الكترومغناطیسی یا نور) به مولكول می‌‌تابد و از خارج آن را تحریك می‌كند.
حالا یك فرق مهم فسفرسانس با فلوئورسانس هم در این است كه در فلوئورسانس هر گاه مولكول شیمیایی تحت اثر انرژی فیزیكی قرار گیرد، آثار آن انرژی را كه به صورت تهییج الكترونی و تغییر مدار چرخش ایجاد شده است را تنها در مدت زمان كوتاهی به صورت نور آزاد می‌كند و با قطع انرژی اولیه فلوئورسانس نیز قطع میشود، ولی در فسفرسانس با قطع منبع انرژی اولیه همچنان تخلیه نور داریم و تابش انرژی نورانی از جسم تا مدتها ادامه می‌‌یابد یعنی همان حالتی كه در ساعت‌های شب‌نما وجود دارد.
– یعنی نوری را كه در طول روز گرفته است، تدریجاً در طول شب از دست میدهد.
– درست است و به همین دلیل دو اصطلاح فلوئورسانس و فسفرسانس را در كتاب‌های فارسی فیزیك دانشگاهی به ترتیب به ”ماهتابی” و ”شب‌تابی” ترجمه می‌كنند كه تا حدودی اساس آن دو پدیده را گواهی می‌كند.
– آیا مزیتی هم در این روش‌ها وجود داشته است كه دستگاه‌های جدید و كیت‌های جدید آزمایشگاهی را معتبر بكند؟
– قطعاً. روش‌های كمی لومینومتری دارای ویژگی بالاتری نسبت به فلوئوریمتری هستند و كمتر تحت تأثیر تداخلات خارجی و اثر فلوئورسانس طبیعی نمونه بیمار و مواد و مولكول‌ها و داروهای موجود در سرم افراد قرار می‌گیرند.
– فسفرسانس چطور؟
– از مواد فسفرسنت كه مطلقاً در آزمایشگاه به عنوان كونژوگه یا مواد نشان‌دار كننده آنتی‌ژن و آنتی‌‌بادی استفاده نمی‌شود.
– چرا؟
– چون در آزمایشگاه احتیاج به مواد حساس و زود واكنش‌گر داریم. اینها در آزمایش‌های كیفی استفاده‌ای ندارند، چون شدت فسفرسانس به اندازه شدت فلوئورسانس نیست. در آزمایش‌های كمی و كمیتی مثل فلوئوریمتری نیز بهتر است كونژوگه درون لوله آزمایش در كسری از ثانیه نسبت به تابش اشعه تحریك‌كننده واكنش نشان دهد و بلافاصله بعد از قطع انرژی تحریكی، سیگنال خود را تماماً ساتع كند و خاموش شود و منتظر تحریك بعدی بماند تا ما بتوانیم فرق بین غلظت‌های پایین و بالای یك آنالیت را تشخیص دهیم. در غیر این صورت مثلاً دیده میشود كه دتكتور دستگاه برای هورمون پرولاكتین كونژوگه شده با مواد فسفرسانس در غلظت كم همان نوری را بیرون می دهد كه در غلظت بالا نمایش میدهد.
– یعنی عملاً خطای زیادی به وجود می‌آید.
بله. بگذریم. باز هم فریب شما را خوردم و از بحث اصلی فاصله گرفتیم. صحبت راجع به چه بود؟
– كمیلومینسانس و هاپتن‌ها
– بلی. اگر دقت كرده باشید در روش‌های رایج ایمونواسی دستگاهی وقتی هاپتن‌ها را اندازه می‌گیریم، گراف‌های به دست آمده از منحنی استاندارد یعنی نمودار dose- response یا dose– signal به صورت نزولی می‌باشد.
یعنی چطور است؟ سیگموئید ؟
نه، البته ممكن است سیگموئید هم باشند، ولی منظور من در اینجا آن است كه رو به پایین است و اصطلاحاً از نوع ”تدریجاً كاهشی” است و دانستن این موضوع برای مدیر آزمایشگاه مهم است.
– چرا؟
– از آنجایی كه اساس تست‌های اندازه‌گیری هاپتن‌هایی مثل تستوسترون و پروژسترون و كورتیزول و … عموماً براساس شیوه رقابتی است و طراحی سنجش در كیت یا الگوی فعل و انفعالات را تقریباً همیشه به شكل Competitive تنظیم می‌كنند، لذا منحنی اینگونه تست‌ها و كیت‌ها همواره به صورت رو به پایین یا ”تدریجاً كاهشی” در می‌آید.
– چیزی كه الان رسم كردید سیگموئید نیست (به تصاویر رجوع شود).
– خب، البته حق با شماست. ظاهر این نمودار سیگموئید نیست و به شكل S نمی‌‌باشد، ولی نزولی است. سیگموئید بودن، همانند خطی بودن یا هذلولی بودن فقط چهره و قیافه (یا به قول معروف پروفایل و نیم‌رخ) نمودار را به ما نشان میدهد در حالی كه مشی و Progression همه این نمودارها می‌تواند نزولی یا صعودی باشد.
پس می‌توانیم نتیجه بگیریم كه هر وقت منحنی حالت سراشیبی و سرپائینی داشت، سیستم در حال اندازه‌گیری یك مولكول كوچك و هاپتنی است؟
– الزاماً خیر. چون گاهی اوقات كیت‌هایی از بعضی شركت‌ها می‌بینید كه فرضاً GH را اندازه می‌گیرد، ولی با الگوی رقابتی. یعنی هر چه GH یك مولكول بزرگ است و می‌توان آن را با شیوه IRMA یعنی متد ساندویچی اندازه‌گیری كرد، ولی از روش RIA یا رقابتی برای آن استفاده شده است.
– بنابراین هر وقت منحنی حالت نزولی داشت، طراحی الایزا از نوع رقابتی بوده است.
– بله. این جمله درست‌تر است. هر چند مطلق نیست، ولی چون امروزه برخلاف روال سابق، روش اندازه‌گیری CPM در مایع آزاد یا در قسمت غیر رسوبی از رواج افتاده است و به طور كلی طراحی كیت‌ها تقریباً به دو شیوه رقابتی و ساندویچی منحصر شده است، لذا قاعده‌ای كه شما گفتید صادق میشود.
– و اگر منحنی دارای شیب رو به بالا بود، طراحی الایزا از نوع ساندویچی میشود.
به طور كلی بلی.
– آقای دكتر محمدی؛ با توجه به این كه بحث بر سر منحنی و انواع آن یا به قول شما بحث نمودار و انواع خطوط روی نمودار است، بفرمائید كه منحنی‌های قلابی به چه صورتند؟
– منظورتان را متوجه نمی‌شوم.
– منحنی هوك كه چند دقیقه پیش تحت عنوان high dose hook صحبت كردید (رجوع شود به ماهنامه شماره 68).
– به شكل هذلولی است…
یك مطلب مهم در این مورد آن است كه اصطلاح high dose hook effect نباید شما را به اشتباه بیندازد كه اصطلاح مشابه و هم خانواده‌ای به صورت Low dose hook نیز حقیقت داشته باشد. البته ما این اصطلاح دوم را هم داریم و در بعضی جاها اشتباه میشود، ولی به دلیل یك استنباط غلط بوده است.
– یعنی واقعیت دارد ولی حقیقت ندارد.
بلی. به عبارت دیگر اینطور نیست كه در بعضی طراحی‌های ایمونواسی، قرار باشد به دلیل مقدار كم آنالیت.
– پس اگر چنین حالتی رخ داد، كه گاهی هم اتفاق می‌‌افتد، این پدیده چه نام دارد؟
– خیلی ساده است. همان مثبت كاذب یا overestimation و افزایش كاذب كه مثلاً به دلیل وجود مواد مزاحم و تداخل‌كننده بوده است نه به دلیل اندك بودن آنالیت. در حضور مقدار كم آنالیت بوده است نه به دلیل ”مقدار كم آنالیت”. بنابراین اصطلاح high dose hook effect را بهتر است فقط hook effect بگوئیم و بس.
– و فرمودید منحنی آن هم به صورت هذلولی است.
– گراف یا نمودار آنها به شكل منحنی است و با ظاهر هذلولی یا حداكیر دو سیگموئید متقارن و به هم چسبیده.
– رو به بالا هستند یا رو به پائین؟
– هم رو به بالا و هم رو به پائین!
سؤال خیلی خوبی است چون فهمیدن اساس پدیده تله یا اثرهوك را برای شما راحت می‌كند.
ادامه در شماره بعد.
