آزمايش ميكروسكوپی نمونه های مدفوع

معمولا” آزمایش میكروسكوپی نمونه های مدفوع متشكل از سه مرحله جداگانه شامل :

 1. تهیه گسترش مستقیم

2. روشهای تغلیظ نمونه 

3. در روشهای رنگ آمیزی دائمی نمونه ها به تدریج روشهای استاندارد مراحل فوق برای همكاران ارسال می گردد .

تهیه گسترش مستقیم ( مرطوب(

گسترش مستقیم را می توان در كوتاهترین مدت و با حداقل امكانات تهیه نمود.
در صورت مثبت بودن آن از نظر وجود انگل، می توان یك گزارش اولیه سریع به پزشك ارائه داد. گزارش نهایی را موكول به انجام آزمایش با استفاده از روشهای تلغیظ و رنگ آمیزی دائمی نمود.
در آزمایش مستقیم به علت برداشت حجم بسیار كمی از مدفوع، امكان دستیابی به انگل خیلی كم است. در صورت یافتن انگل، به علت اینكه بعضی از تك یاخته ها خیلی كوچك می‌باشند. به سختی می توان در گسترش مستقیم نوع آنها را تعیین نمود .

اهداف تهیه گسترش مستقیم  

 -1ارزیابی میزان آلودگی بیمار
۲- تشخیص سریع نمونه هایی با آلودگی شدید 
۳- بررسی حركت ارگانیسم 

این روش آماده سازی برای نمونه های تازه مدفوع كه در یخچال نگهداری نشده و یا با مواد نگهدارنده مخلوط نگردیده است، می باشد. این روش ، مراحل مختلف زندگی اغلب انگلهای روده ای ( تروفوزوئیت، كیست، لارو و تخم )، اووسیست كوكسیدیاها، اجسام كروماتوئید موجود در كیست و حركت تروفوزوئیت ها را نشان می دهد.

در مورد نمونه های تازه ای كه در ماده نگهدارنده قرار داده نشده اند، محلول ۸۵% كلرورسدیم در آب و یا محلول ید به عنوان رقیق كننده استفاده می شود. برای نمونه های نگهداری شده در فرمالین و یا مواد نگهدارنده دیگر، مواد نگهدارنده نقش رقیق كننده را نیز ایفا می كنند.

باید توجه نمود كه ید و مواد نگهدارنده مانند فرمالین باعث كشته شدن ارگانیسم شده و حركت آن را نمی توان بررسی نمود.
تهیه گسترش مستقیم با محلول ید باعث می شود كه هسته و بیشتر عناصر داخل كیستهای انگل مشخص گردند. معمولا” در این گونه آماده سازی، تروفوزوئیت ها شكل طبیعی خود را از دست می دهند. پژوهشگران تخم کرم‌ها و لاروها را شناسایی می‌کنند، اما گاهی جزئیات داخلی آن‌ها را به‌طور مشخص تشخیص نمی‌دهند.

متخصصین برای تشخیص اولیه اووسیست كریپتوسپوریدیوم تهیه نمونه با محلول ید پیشنهاد می کنند. معمولا” اووسیستها ید را جذب نكرده و شفاف می مانند) بر خلاف مخمرها و دیگر عناصر مدفوع كه رنگ زرد ید را جذب می نمایند).  تشخیص قطعی كریپتوسپوریدیوم با رنگ آمیزی های اختصاصی و یا استفاده از كیت دارای آنتی بادی منوكلونال اختصاصی انجام می شود .

اووسیست ایزوسپورابلی در گسترش مستقیم دیده می شود. اسپورهای میكروسپوریدیا آنقدر كوچك هستند كه ممكن است با ذره های كوچك موجود در محیط اشتباه شوند. بنابراین در گسترش مستقیم ممكن است تشخیص صحیح داده نشوند.

در امتحان میكروسكوپی نمونه مدفوع ممكن است عناصر زیر دیده شوند :

 -1 ترفوزوئیت و كیست تك یاخته های روده ای

۲- اووسیست كوكسید یا و اسپورهای میكرسپوریدیا كه تشخیص این اسپورها از ذره های كوچك موجود در محیط مشكل است .

 -3تخم كرمها و لاروها

۴- گلبولهای قرمز كه ممكن است دلیل زخم یا عوامل دیگر خونریزی دهنده باشد .

۵- گلبولهای سفید مخصوصا” نوتروفیلها كه ممكن است دلیل التهاب باشد .

 -6ائوزینوفیلها كه معمولا” دلیل وجود یك پاسخ ایمنی است ( كه ممكن است در ارتباط با وجود عفونتهای انگلی و یا علل دیگر باشد(.

۷- ماكروفاژها كه ممكن است به دلیل حضور عفونتهای باكتریایی یا انگلی باشد .

-8كریستال های شاركوت لیدن كه بقایای ائوزینوفیلهای تخریب شده است (ممكن است در ارتباط با وجود عفونتهای انگلی و یا علل دیگر باشد(.

 -9قارچ ها ( انواع كاندیدا ) و مخمرهای دیگر و یا قارچ های شبه مخمر .

 -10سلول های گیاهی ، دانه های گرده و اسپورهای قارچ ها كه ممكن است شبیه تخم كرم ها، كیست تك یاخته ها و اووسیست كوكسیدیا و اسپورهای میكروسپوریدیا باشد .

-11  فیبر یا ریشه گیاهان و یا موی حیوانات كه ممكن است شبیه لارو كرم ها باشد .

تهیه محلول سرم فیزیولوژی

1–  ۰.۸۵ گرم كلرورسدیم (Nacl ) را در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر به خوبی حل كنید .به میزان 10 میلی لیتر به داخل 10 لوله در پیچ دار بریزید. لوله ها را در دمای C121 به مدت 15 دقیقه اتوكلاو نمائید و بعد از سردشدن در یخچال C4 نگهداری كنید.(در صورت در دسترس نبودن لوله در پیچ دار پس از استریل نمودن، می توان جهت جلوگیری از تبخیر محلول، در لوله را با پارافیلم كاملا” ببندید). روی برچسب لوله نام محلول و تاریخ انقضای آن را به مدت حداكثر یك سال بعد از تاریخ ساخت بنویسید .

تهیه محلول iodine‘Anton’D
مواد لازم :
۱- یدور پتاسیم  Potassuim iodide = k1) گرم یک گرم)
۲- كریستال ید پودر شده ( Iodine crystals ) ۵ گرم
 -3آب مقطر تا ۱۰۰ میلی لیتر

یدور پتاسیم و كریستالهای ید را در آب مقطر حل كنید. (مقدار اضافی كریستالهای حل نشده ید در ته ظرف باقی می ماند كه به دلیل وجود این كریستالها، محلول ذخیره در مدت زمان طولانی، دارای كیفیت مطلوب می باشد. بنابراین محلول را صاف ننمائید.(

محلول فوق را در شیشه قهوه‌ای‌رنگ بریزید و آن را در محل تاریک و در حرارت اتاق نگهداری کنید. از این محلول برای استفاده فوری استفاده کنید؛ بنابراین مقداری از آن را به‌عنوان محلول کاری در دسترس قرار دهید. رنگ محلول کاری باید شبیه چای پررنگ باشد و اگر در مدت ۱۰ تا ۱۴ روز رنگ آن روشن‌تر شد، آن را دور بریزید.

روی برچسب شیشه محتوی محلول ذخیره، نام محلول و تاریخ انقضای آن را به مدت حداكثر یكسال بعد از تاریخ ساخت بنویسید.

تهیه محلول لوگل ( Lugols iodine )
مواد لازم :

۱- یدور پتاسیم ۱۰ گرم،
-2 كریستال ید پودر نشده ۵ گرم،
3 –آب مقطر ۱۰۰ میلی متر
)مراحل اشاره شده در مورد تهیه محلول ید و این محلول مشابه است(

جهت ساخت محلول كاری از محلول ذخیره به نسبت ۱:۵ آن را با آب مقطر رقیق و داخل شیشه قهوه ای رنگ ( قطره چكان ) نگهداری می نمائیم.