کاربرد روش‌های تشخيص مولکولی برای شناسايی عفونت قارچیMucormycosis

پيام بهزادی-عضو هيأت علمی گروه ميکروب‌شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس (نويسنده‌ي‌ مسئول مکاتبات)

الهام بهزادی– گروه ميکروب‌شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس

 

در حال‌حاضر زيست‌شناسی مولکولی توانسته است افق‌های نوينی را در گرايش‌های مختلف قارچ‌شناسی و از جمله قارچ‌شناسی پزشکی بر روی متخصصين بگشايد. گسترش زيست‌شناسی مولکولی در عرصه‌های تشخيصی و بالينی موجب شده است تا بتوان زندگی‌های بيشتری را از خطر مرگ نجات داد و با نگاه ديگری به آينده چشم دوخت.

در گذشته، به دليل عدم وجود روش‌های تشخيصی سريع و به موقع بسياری از بيمارانی که سيستم ايمنی ضعيفی داشته و مورد حمله‌ی عوامل عفونت‌زای قارچی قرار می‌گرفتند، بعد از مدتی با گسترش عفونت به بخش‌های مختلف بدن، امکان درمان بيمار وجود نداشت و پس از گذشت زمانی نه چندان طولانی مرگ، پايان چنين افرادی بود. اما امروزه با نفوذ زيست‌شناسی مولکولی به عرصه‌های تشخيصی، می‌توان با تشخيص سريع عامل عفونت اقدام به درمان کامل بيمار نمود.

Mucormycosis يک عفونت قارچی بسيار مهم به‌شمار می‌رود، زيرا ميزان مرگ و مير در بيمارانی که دارای نقص سيستم ايمنی بوده و به اين عفونت قارچی دچار می‌شوند، بسيار بالاست. از اين گروه می‌توان به بيمارانی اشاره کرد که مبتلا به ديابت مليتوس و يا نوتروپنی هستند و يا اقدام به پيوند بافت يا اعضا نموده و به دليل استقرار پيوند مربوطه می‌بايستی برای مدت زمان مشخصی از داروهای مزبور استفاده نمايند. با توجه به نقص در سيستم ايمنی بيماران، امکان بروز عفونت‌های ميکروبی مختلف وجود دارد که در اين ميان می‌توان به تهاجم عفونت‌های قارچی رشته‌ای مانند اعضای رده‌ی Zygomycetesاشاره نمود. اين گروه از قارچ‌ها نسبت به بسياری از داروهای ضدقارچی مانند Caspofunginو Voriconazoleمقاوم هستند.

تشخيص عفونت قارچی Mucormycosis مشکل است، زيرا معمولاً کشت بافت‌های آلوده به اعضای رده‌ی Zygomycetes منفی بوده و آزمون‌های سرم‌شناسی متداولی برای آنها در دسترس نمی‌باشد. همچنين، امکان شناسايي جنس و گونه‌ی قارچی از طريق بافت‌شناسی غير ممکن است. به‌علاوه، اگر کشت نمونه‌ها نيز مثبت گردد، شناسايي گونه‌ی قارچی بسيار زمان‌گير خواهد بود؛ زيرا می‌بايستی از طريق متخصصين آزمايشگاه‌های مرجع گونه‌ی مربوطه شناسايي و تأييد شود. حتی در حال حاضر، استفاده از روش کشت برای شناسايي عوامل قارچی مسبب Mucormycosis بسيار متداول و مرسوم است. از مهم‌ترين جنس‌های اعضای رده‌ی Zygomycetes می‌توان به Rhizopus، Absidia، Mucor و Rhizomucor اشاره کرد. همچنين ديگر گونه‌های مهم اين رده شامل قارچ‌هايي نظير Apophysomyceselegans، Cunninghamella bertholletiae، Cokermycesrecurvatus، –Saksenaea –vasiformis  و Syncephalastrum racemosum می‌باشند.

با توجه به مشکلاتی که در زمينه‌ی روش‌های تشخيصی بالينی متداول و سنتی وجود دارد، پژوهشگران پيوسته به ‌دنبال روش‌های دقيق‌تر، آسان‌تر و سريع‌تر هستند. به همين دليل، در سال‌های اخير زيست‌شناسی مولکولی، به عرصه‌ی قارچ‌شناسی پزشکی نيز راه پيدا کرده و افق‌های بسيار اميدوارکننده‌ای را برای متخصصين اين رشته گشوده است. استفاده از هدف‌های مولکولی متفاوت شامل ژن‌های محافظت‌شده‌ی DNA ريبوزومی و ژن‌های مناطق متغير از نسخه‌های داخلی جداکننده Internal Transcribed Spacer (ITS) که قابليت تفکيک بين‌گونه‌ای را بدست
مي‌دهد، رايج‌ترين روش‌های تشخيص مولکولی برای قارچ‌ها هستند.

برای شناسايي عوامل قارچی اعضای رده‌ی Zygomycetes، DNA ريبوزومی دربردارنده‌ی منطقه‌ی ITS1-5.8S-ITS2 بوسيله‌ی پرايمرهای يونيورسال قارچی تکثير می‌گردد. بهترين روش برای تهيه و ساخت پرايمرهای مربوطه، استفاده از نرم‌افزارهای رايانه‌ای است که در حال حاضر شمار آنها روز به روز رو به افزايش است. بنابراين با کمک نرم‌افزارهايي چون OligoPrimer Analysis، BioEdit Sequence Alignment Editor و Sequencher می‌توان اقدام به شناسايي توالي‌های هومولوگ کرد که برای هر يک از جنس‌های تشکيل‌دهنده‌ی رده‌ی Zygomycetes منحصر به فرد بوده، مناطق مناسب را برای پرايمرها و پروب‌ها پيدا کرد. از پرايمرهای قابل استفاده می‌توان به موارد زير اشاره نمود:

V9D (5′-TTAAGTCCCTGCCCTTTGTA-3′)

LS266 (5′-GCATTCCCAAACAACTCGACTC-3′)

Mucor1 (5′-WTTACC RTG AGC AAA TCA GA-3′)

Mucor2 (5′-CAA TCY AAG AAT TTC ACC TCTAG-3)

همچنين برای شناسايي شش جنس Rhizopus، Absidia، Mucor، Apophysomyces، Cunninghamella و Saksenaeaمی‌توان از پرايمرهای رفت و برگشت زير استفاده نمود:

Forward (5′-TAGGAATTACAGCAAAT-3′)

Reverse (5′-CCAATGCAAACTCC-3′)

پرايمرهای مزبور برای تکثير يک منطقه‌ی 167 جفت بازی از ژن سيتوکروم b مورد استفاده قرار می‌گيرند.

همچنين، بايستی توجه داشت که برای تجزيه و تحليل درستی توالی پرايمرها می‌توان از نرم افزار BLAST که در پايگاه داده‌های NCBI وجود دارد کمک گرفت.

با توجه به بررسی‌های انجام شده، طول منطقه‌ی ITS1 بين 132 تا 269 جفت باز و طول منطقه‌ی ITS2 بين 173 تا 257 جفت باز متغير می‌باشد.

با توجه به اتفاق نظری که ميان متخصصين آزمايشگاهی وجود دارد، شناسايي گونه‌های مختلف رده‌ی Zygomycetes به کمک کشت معمولی، روشی بس دشوار و زمان‌بر بوده و حتی در مواقعی که پاسخ کشت نيز مثبت می‌گردد، شناسايي ميکروسکوپی آن نياز به کارشناسی ويژه داشته و می‌بايستی نمونه به آزمايشگاه مرجع فرستاده شود، اما از طرفی بايد توجه داشت که شناسايي توالی DNA برای تشخيص جنس‌های رده‌ی Zygomycetes از يکديگر و يا از ديگر رده‌های قارچی در زمينه‌ی حساسيت آنها نسبت به عوامل ضد قارچی از اهميت بسيار ويژه‌ای برخوردار می‌باشد.

در مواردی که از روش‌های رنگ‌آميزی بافت استفاده می‌گردد و ميزان نمونه‌ها نيز در بافت اندک است، گونه‌های Aspergillus از گونه‌های اعضای تشکيل دهنده‌ی رده‌ی Zygomycetes قابل تشخيص نمي‌باشند. به همين دليل است که استفاده از روش‌های تشخيص آزمايشگاهی سريع، از اولويت بالايي برخوردار هستند. در سال‌ها اخير، بررسی‌ها و مطالعات گوناگون نشان داده‌اند که روش‌های تشخيص مولکولی برای شناسايي درست و سريع گروه وسيعی از قارچ‌ها کارآمد بوده و جهت شناسايي عوامل عفونت‌زای قارچی که از نمونه‌های بالينی جدا شده‌اند بسيار مناسب است.

در حال حاضر با توجه به پژوهش‌های بنيادينی که انجام گرفته، کاملا” مشخص و مبرهن است که توالی‌های ITS از همسانی بسياری بالايي در ميان سويه‌های هر يک از گونه‌های اعضای تشکيل دهنده‌ی رده‌ی Zygomycetesبرخوردار بوده، در حالیکه از ميزان اين همسانی در ميان گونه‌های رده‌ی مزبور بسيار کاسته می‌گردد. اين نتايج نشان می‌دهند که با استفاده از توالی ITS و با بکارگيری روش‌های مولکولی مربوطه، می‌توان به درستی و در مدتی کوتاه اقدام به شناسايي جنس‌ها و
گونه‌های اعضای تشکيل دهنده‌ی رده‌ی Zygomycetes نمود. در واقع، استفاده از توالی ناحيه‌ی ITS برای قارچ‌های مزبور، حکم بارکد DNA را دارد.

بنابراين، بررسی‌های انجام شده تأکيد مثبتی برای استفاده از توالی ITS جهت شناسايي جنس‌ها و گونه‌های اعضای تشکيل دهنده‌ی رده‌ی Zygomycetes عامل بيماری قارچی Mucormycosis دارند.

منابع:

1)www.emedicine.com, Infectious diseases, Mucormycosis, 2008

2)Singleton, P., Sainsbury, D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, John Wiley and Sons, 3rd Edition, 2002

3)Dannaoui E., Meis J.F., Mouton J.W., Verweij P.E. In vitro susceptibilities of Zygomycota to polyenes. J Antimicrob Chemoter, 2002; 49:741-744

4)Dromer F., McGinnis M.R. Zygomycosis. Churchill Livingstone, 2002; 297-308

5)Schwarz P., Bretagne S., Gantier J.Ch., Garcia-Hermoso D., Lortholary O., Dromer F., Dannaoui E. Molecular Identification of Zygomycetes from Culture and Experimentally Infected Tissues. JCM, 2006; 44:2,340-349

6)Hata D.J., Buckwalter S.P., Pritt B.S., Roberts G.D., Wengenack N.L. Real-Time PCR Method for Detection of Zygomycetes. JCM, 2008; 46:7,2353-2358

7)Wengenak N.L., Binnicker M., Fungal Molecular Diagnostics, Clin Chest Med 2009; 30,391-408

8)http://www.ncbi.nlm.nih.gov