آزمایشگاه و نمونه‌های قارچ‌شناسی

صادق خداویسی – کارشناسی ارشد قارچ‌ شناسی پزشکی

به منظور تشخیص درست عفونت‌های قارچی و بدست آوردن نتایج دقیق، جمع‌آوری و بررسی صحیح نمونه از بیماران مراجعه‌کننده به آزمایشگاه از اهمیت فوق‌العاده‌ای برخوردار می‌باشد. باید همیشه به خاطر داشت که نتایج نهایی آزمایشگاه فقط آنقدر می‌تواند ارزشمند باشد که نمونه‌ای که با آن کار می‌شود، خوب و به طور مناسب جمع‌آوری شده باشد. به همین منظور باید از روش‌های درست نمونه‌گیری، نوع نمونه و تکنیک‌های آزمایشگاهی مناسب استفاده شود.

اولین و مهم‌ترین مرحله نمونه‌گیری قارچ‌شناسی، پذیرش می‌باشد که در طی آن باید نکات ذیل رعایت شود:پزشک معالج باید نوع عفونت احتمالی و اطلاعات زمینه‌ای کافی را در اختیار آزمایشگاه قرار دهد. باید مطمئن شویم که فرد بیمار حداقل از 72 ساعت قبل محل مشکوک به ضایعه قارچی را نشسته و از هیچ کرم، روغن و یا داروهای خوراكی یا موضعی استفاده نکرده باشد. چون‌که در صورت استفاده از این مواد و یا شستشو ممکن است بررسی‌های مستقیم میکروسکوپی و کشت بطور کاذب منفی شود. سپس در صورت داشتن شرایط نمونه‌گیری، مشخصات فرد بیمار (نام و نام خانوادگی، سن، جنس، شغل، محل زندگی، سابقه مسافرت، سابقه تماس با حیوان و محل ضایعه قارچی) را ثبت کرده و از وی نمونه‌گیری به عمل خواهد آمد. در صورت انتقال نمونه به آزمایشگاه، باید دقت شود که مقدار نمونه باید کافی باشد و انتقال در اسرع وقت صورت گرفته باشد و به استثنای نمونه‌های پوست، مو و ناخن سایر نمونه‌های قارچی در ظروف استریل جمع‌آوری شده و در شرایط استریل با برچسب مشخصات نمونه و بیمار بطور واضح پذیرش شود.

نمونه‌گیری بر حسب نوع عفونت، ناحیه درگیر، علائم بالینی بیمار و درخواست پزشک معالج متفاوت خواهد بود. بیماری‌های قارچی به چند صورت؛ سطحی، جلدی، زیر جلدی و احشایی بوده که در ذیل نحوه نمونه‌گیری و انواع نمونه‌های هر کدام از این بیماری‌ها توضیح داده خواهد شد.
•      در بیماریهای قارچی سطحی، ابتدا باید محل ضایعه را با الکل 70درصد به خوبی پاک کرده تا باکتری‌های سطحی و فرصت‌طلب‌های قارچی را از میان بردارد. سپس بوسیله تراشیدن جلد با اسکالپل از حاشیه زخم و از نواحی که بیشتر مبتلا به نظر می‌رسد، پوسته‌ها را جمع‌آوری کرده و در صورتیکه در محل زخم پوسته وجود داشته باشد، بهتر است از نوار چسب اسکاچ جهت نمونه‌گیری مناسب استفاده شود. همچنین در بیماریهای سطحی مونیز موهای ناحیه آلوده را قیچی كرده و برداشت نمود.
•      در بیماریهای قارچی جلدی، در صورت ضایعات مو، نمونه‌برداری باید در زیر چراغ وود (366 نانومتر) و یا نور طبیعی صورت گیرد. ایجاد فلورسانس یکی از خصوصیات بیماری‌های درماتوفیتی می‌باشد که توسط برخی گونه‌ها تولید می‌شود. ناحیه مورد نظر را با الكل 70 درصد تمیز نموده و سپس بوسیله پنس سرپهن یا موچین حدود 10 تار مویی كه شكسته یا تغییر رنگ داده، كدر یا غلاف‌دار را كنده و جمع‌آوری میكنیم. برداشت سطحی موها بی‌ارزش می‌باشد، زیرا عفونت معمولاً در نزدیکی سطح پوست و در مجاورت فولیکولهای مو مستقر می‌گردد. در ضایعات پوستی مظنون به بیماری‌های قارچی نیز نمونه‌گیری پس از تمیز نمودن با الکل، با استفاده از اسكالپل كنداستریل یا استفاده از برس سر، انجام خواهد گرفت.برای استفاده مجدد برس، ابتدا باید با کلروهگزیدین 1 درصد به مدت یک ساعت استریل شده و سپس با آب استریل آبکشی شود. در صورت نمونه‌گیری ازضایعات ناخن نیزبایستی پس از تمیز کردن ناخن باالكل، قسمت آزاد ناخن را بوسیله ناخن‌گیر كاملاً جدا كرده و دورریخته شود. توسط اسكالپل استریل از قسمت‌های تغییر رنگ یافته، تغییر شکل داده یا نواحی ترد و شکننده، حدفاصل ناحیه سالم وآسیب‌دیده را تراشیده و تراشه‌های اولیه را دور ریخته و سپس مقداری از تراشه‌های گرفته شده از نزدیك بستر ناخن را جمع‌آوری میكنیم. در این نمونه جهت شفاف کردن ناخن می‌توان از پتاس 20٪ وکمی حرارت استفاده کرد.
•      در بیماری‌های قارچی زیرجلدی، نمونه ممکن است از ضایعات گرانول‌ها و چرک دملهای باز، تراوشات اگزودای ضایعات، مایع مجاری تخلیه‌ای یا دملهای سربسته و یا به وسیله بیوپسی جمع‌آوری شود. تا حد امکان نباید از سواب برای جمع‌آوری ترشحات زخم و درناژ آن استفاده کرد. نمونه‌گیری با تراشه از قسمت‌های کروت دار و از عمق مرکز و لبه ضایعه فعال با اسکالپل استریل صورت پذیرفته و همچنین محتویات آبسه‌های زیر جلدی و محتویات سینوسی با استفاده از سرنگ استریل آسپیره می‌شود. در صورت مشاهده دانه در بیماری مایستوما، جمع‌آوری دانه‌ها ضروری است. با قرار دادن یک گاز استریل مرطوب شده با نرمال سالین بر روی ضایعه و برداشتن آن و با به دام افتادن گرانول‌ها در تار و پود گاز، نمونه جمع‌آوری می‌گردد. به رنگ گرانول‌ها باید توجه شود، چرا که یک کلید برای شناسایی ارگانیسم مسببه می‌باشد. در مواردی‌که اکتینومایسس عامل مسببه باشد، تمامی نمونه‌ها در ظروف غیر‌هوازی نگه داشته می‌شود.
•      در بیماری‌های قارچی احشایی، نمونه‌ها ممکن است شامل چرک یا اگزودای زخم‌ها، مایع نخاع، ادرار، خلط، مایع برونکوآلوئولار لاواژ (BAL) [1]، خون محیطی، پونکسیون مغز استخوان و یاآبسه‌های مسدود، غدد لنفاوی و نسوج بدست آمده توسط بیوپسی یا اتوپسی باشد. از کشت خون در موارد مشکوک به بیماری‌های قارچی عمقی استفاده می‌شود. جداسازی موفق عوامل قارچی از کشت خون به فاکتورهایی از قبیل؛ حجم نمونه اخذ شده، تعداد دفعات نمونه‌گیری و روش فرآوری نمونه‌ها وابسته است. با استفاده از محیط‌های کشت دی‌فازیک و تهویه هوایی مناسب، احتمال جداسازی ارگانیسم افزایش می‌یابد. حساسترین و سریعترین روش تشخیص فانگمی، روش لیز و سانتریفوژ می‌باشد، ولی نسبت به روشهای دیگر پرهزینه و پرزحمت‌تر است. امروزه از سیستم‌های کشت خون اتوماتیک و اصلاح ترکیبات محیط کشت خون بکارگیری می‌شود.  نمونه خون را می‌توان به لوله‌های خلاء انتقالی حاوی 0/35 در‌صد پلی‌آنتول‌سولفونات (SPS) برای انتقال بعدی به محیط کشت خون در آزمایشگاه کشید و یا نمونه خون مستقیماً به داخل محیط کشت خون در کنار بستر بیمار کشیده می‌شود. جهت نمونه‌گیری مایع مغزی-نخاعی حدود یک میلی‌لیتر مایع مغزی-نخاعی به طریق آسپتیک جمع‌آوری شده و در لوله استریل جمع‌آوری می‌شود. نمونه اخذ شده ابتدا سانتریفوژ و سپس مایع رویی آن جهت انجام تستهای سرولوژی بکار می‌رود و قسمت رسوبی آن جهت کشت در محیط‌های هوازی (در صورت شک به اکتینومایسس تلقیح در محیط بی‌هوازی) و بررسی مستقیم میکروسکوپی استفاده می‌شود. نمونه ادرار میانی به شرط اینکه توسط واژن و یا پره‌آنال آلوده نشود، برای بررسی‌های قارچ‌شناسی مناسب است. آسپیراسیون بالای پوبیس در نوزادان بهترین روش جمع‌آوری نمونه ادرار می‌باشد. با ماساژ پروستات قبل از ادرار کردن می‌توان عوامل مسببه پروستاتیت نظیر کریپتوکوکوس نئوفورمنس، هیستوپلاسما کپسولاتوم یا کوکسیدیئیدس ایمیتیس را خصوصاً در بیماران ایدزی برداشت کرد. نمونه ادرار بلافاصله سانتریفوژ شده و مورد بررسی میکروسکوپی و کشت قرار می‌گیرد. همچنین می‌توان در آن به جستجوی آنتی‌ژنهای قارچی پرداخت.نمونه ادرار 24 ساعته و با استفاده از ظرف لگن بعلت رشد عناصر آلوده‌کننده و باکتری‌ها به تعداد فراوان درون آن، جهت بررسی‌های قارچ‌شناسی فاقد ارزش تشخیصی می‌باشند. در صورت انتقال نمونه باید در ظرف استریل و سریع به آزمایشگاه ارسال گردد. نمونه خلط صبحگاهی در ظرف استریل جمع‌آوری و باید تا 2 ساعت بعد از جمع‌آوری نمونه مورد آزمایش قرار گیرد. اگر بیمار قادر به دفع خلط نباشد از روش شستشوی برونشی بمنظور تهیه نمونه استفاده می‌کنند. توصیه می‌شود حداقل 3 نمونه خلط برای آزمایشهای میکروسکوپی و کشت گرفته شود. شستشوی برونشی و نمونه BAL روش‌های مناسبی برای نمونه‌گیری از دستگاه تنفس تحتانی هستند. بیوپسی به روش برونکوسکوپی برای تهیه نمونه مناسب انجام می‌گیرد؛ نمونه ابتدا سانتریفوژ شده و سپس رسوب آن مورد آزمایش قرار می‌گیرد. خلط موکوئیدی را می‌توان پیش از بررسی بوسیله تریپسین، پانکراتین 0/5 درصد و یا ان ‌-استیل ال-سیستئین هموژن نمود. در بیماریهای قارچی از قبیل هیستوپلاسموزیس، کریپتوکوکوزیس و پاراکوکسیدیوئیدومیکوزیس، نمونه مغز استخوان راهنمای تشخیصی مؤثری است. حدود 3 تا 5 میلی‌لیتر مواد آسپیره در داخل ظروف استریل هپارینه با رقت (1/1000)جمع‌آوری می‌شود. نمونه بافتی گرفته شده به وسیله بیوپسی در سالین استریل و نه آنرا در فرمالین جمع‌آوری می‌شود. برداشت کامل ضایعات کوچک جلدی، زیرجلدی و یا مخاطی اغلب امکان‌پذیر است و تا حد امکان هم از مرکز ضایعات و هم از حاشیه آن نمونه‌برداری صورت می‌پذیرد.

نمونه‌ها و محیط‌های کشت پیشنهادی جهت جداسازی عوامل قارچی  بیماری نوع نمونه محیط کشت بیماری‌های سطحی                                          پیتریازیس ورسیکالر تراشیدن پوست غیر ضروری تینه‌آ نایجر تراشیدن پوست سابورودکستروز آگار + کلرامفنیکل پیدرا بریدن مو سابورودکستروز آگار بیماری‌های جلدی                                             کچلی سر بریدن و کندن مو سابورودکستروز آگار + کلرامفنیکل DTM(DermatophyteTest Medium) کچلی بدن تراشیدن مو و پوست “ کچلی ناخن تراشیدن ناخن سابورودکستروز آگار+کلرامفنیکل کاندیدیازیس تراشیدن پوست، ناخن و مو، مخاطات و واژینال “ بیماری‌های زیر جلدی                                           کروموبلاستومایکوزیس کبره‌ها (پوسته‌های سخت)،اگزوداها و مواد مترشحه زخم‌ها سابورودکستروز آگار+ کلرامفنیکل مایستوما (مادرومایکوزیس) چرک سینوسهای مترشحه، مایعات آسپیره، بیوپسی سابورودکستروز آگار Brain-heart infusion agar Brain-heart infusion blood agar فائوهایفومایکوزیس خلط، BAL، مایعات بدن، چرک، خراشیدن قرنیه سابورو دکستروزآگار + کلرامفنیکل اسپروتریکوزیس چرک زخمهای شده، آسپیره مایعات بدن، BAL “ رینوسپوریدیوزیس بیوپسی بینی یا چشم، تراشیدن پوست وجود ندارد بیماری‌های سیستمیک                          کاندیدیازیس CSF، خلط، BAL، ادرار، مدفوع، خون سابورودکستروز آگار + کلرامفنیکلBrain-heart infusion biphasic Blood culture medium کریپتوکوکوزیس تراشیدن زخم‌های پوستی، ادرار، مغز استخوان، خون، خلط،  CSF سابورودکستروز آگار + کلرامفنیکل Bird (niger) seed ژئوتریکوزیس خلط، شستشوی برونش سابورودکستروز آگار+کلرامفنیکل بلاستومایکوزیس (آمریکای شمالی) تراشیدن لبه‌های زخم‌ها، چرک آبسه‌ها ادرار، خلط، BAL سابورودکستروز آگار+ کلرامفنیکل Brain-heart infusion agar Yeast extract phosphate medium پاراکوکسیدیوئیدومایکوزیس تراشیدن لبه‌های زخم‌ها تراشیدن غشاهای موکوئیدی، بیوپسی غده‌های لنفاوی، شستشوی برونش، چرک آبسه‌ها و سینوس‌ها، خلط سابورودکستروز آگار+ کلرامفنیکل Brain-heart infusion agar Yeast extract phosphate medium کوکسیدیومایکوزیس ادرار، خلط، شستشوی برونش، CSF، تراشیدن زخم‌ها، چرک آبسه‌ها و سینوس‌ها سابورودکستروز آگار+آنتی‌بیوتیک Yeast extract phosphate medium هیستوپلاسموزیس خون، مغز استخوان،  CSF خلط، شستشوی برونش، خراشیدن زخم‌های پوست، چرک سینوس‌ها یا زخم‌ها Yeast extract phosphate medium Blood agar Emmons modified sabouraud agar+blood بیماری‌های  ناشی از قارچ‌های رشته‌ای                   آسپرژیلوزیس خلط، BAL سابورودکستروز آگار+کلرامفنیکل زایگومایکوزیس خلط، BAL، بیوپسی سابورودکستروز آگار+کلرامفنیکل هیالوهایفومایکوزیس خلط، BAL، تراشیدن ناخن، بیوپسی، خون، مایعات بدن، تراشیدن قرنیه سابورو دکستروزآگار+کلرامفنیکل اتومایکوزیس پوسته‌ها و شوره‌ها سابورودکستروز آگار+کلرامفنیکل اکتینومایست‌ها اکتینومایکوزیس چرک از سینوس‌های ترشحی، مایعات آسپیره شده، خلط، مایع نخاعی Brain-heart infusion blood agar all anaerobic,37 0C نوکاردیازیس چرک از سینوس‌های ترشحی، مایعات آسپیره شده، خلط، مایع نخاعی سابورودکستروز آگار Brain-heart infusion blood agar (نگهداری در دمای اتاق و 37 درجه) Paraffin bait technique