سیستم گروه خون ارهاش

دکتر حبيب‌ا..گل‌افشان

سیستم ارهاش یکی از سیستم‌های پیچیده گروه خون و دارای کد 004 از سوی کمیته بین‌المللی انتقال خون (ISBT) است. دو ژن رمزدهنده آنتی‌ژن‌های این سیستم بنام‌های RHD و RHCE روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره یک قرار داشته و تا کنون بیش از 50 آنتی‌ژن در ارتباط با آن شناسایی شده است. گمان می‌رود که نقش بیولوژیک این سیستم انتقال آمونیوم و یا تنظیم نامتقارن لیپیدهای غشاء باشد.

پروتئین‌های ارهاش از 417 اسید آمینه تشکیل شده‌اند و به صورت مارپیچی 12 بار عرض غشاء را طی می‌کنند. آرایش مارپیچی پروتئین‌های ارهاش موجب ظهور 6 حلقه یا لوپ پروتئینی در سطح خارجی غشاء می‌شود و شاخص‌های آنتی‌ژنی ارهاش روی همین لوپ‌ها شکل می‌گیرند. پروتئین‌های ارهاش غیرقندی و بسیار آب‌ گریز هستند و هر پروتئین آن دارای دو تا سه مولکول پالمیتات (اسید چرب 16 کربنه) با پیوند کووالانس است. پروتئین‌های ارهاش از 417 اسید آمینه تشکیل شد‌ه‌اند و به صورت مارپیچی 12 بار عرض غشاء را طی می‌کنند.

ژن‌های RHD و RHCD هر کدام دارای 10 اگزون یا ناحیه رمزدهنده هستند. فراورده پروتئینی ژن‌ها 92% شباهت دارند. پروتئین مارپیچی D فراورده ژن RHD در 35-32 اسید آمینه اختصاصی با فراورده ژن RHCE متفاوت است و در حال حاضر 9 اسید آمینه اختصاصی به عنوان اپی‌توپ یا شاخص عملکردی در سطح لوپ‌های 3 و 4 و 6 پروتئین D شناسایی شده است.

مارپیچ‌های پروتئینی ارهاش برای جا گرفتن در غشای گلبول قرمز احتیاج به گلیکوپروتئینی بنام گلیکوپروتئین همراه با ارهاش (RHAG (Rh associated glycoprotein) دارند. ژن مربوط به RHAG روی بازوی کوتاه کروموزوم 6 قرار داشته و فراورده پروتئینی آن با 409 اسید آمینه ساختاری مارپیچی پروتئینی شبیه سیستم ارهاش داشته و حدود 36% شباهت با ژن RHD و RHCE دارد. ژن RHAG نیز دارای 10 اگزون می‌باشد. آنچه که از سیستم ارهاش روی غشای گلبول تولید می‌شود، کمپلکس‌های پروتئینی ارهاش است که از دو مولکول پروتئینی ارهاش (RHD و RHCE) و دو مولکول RHAG به صورت تترامر تشكيل شده است.

فقدان یا اختلال عملکردی RHAG موجب سندرم ارهاش نول با فقدان تمام آنتی‌ژن‌های ارهاش یا ارهاش مد (Mod) با تضعیف آنتی‌ژن‌های ارهاش می‌شود. سیستم ارهاش منحصراً روی گلبول‌های قرمز تولید می‌گردد و پروتئین‌های ارهاش برای پایداری و انسجام اسکلتی غشاء لازم هستند و شاهد این ادعا سندرم ارهاش نول است که با همولیز مزمن و مرفولوژی استوماتوسیت همراه است. در سیستم ارهاش پنج آنتی‌ژن اصلی با استفاده از 5 معرف گروه‌ بندی بنام‌های D و C و E و c و e نام‌گذاری گردیده که دارای بیشترین ارزش بالینی هستند.

آنتی‌ژن D درمیان گروه‌های خون به غیر از ABO از بیشترین خاصیت تحریک‌ کنندگی یا ایمونوژنسیته برخوردار است. ترتیب خاصیت تحریک آنتی‌ژنی در سیستم ارهاش به صورت D>c>E>C>e می‌باشد و شیوه وراثت ژن‌های ارهاش در سه نظریه یا مدل در طول زمان ارائه شده است.

جدول زیر نامگذاری‌های 5 آنتی‌ژن شایع ارهاش را نشان می‌دهد.

شماره گذاری روزفیلد	نامگذاری فیشر و رایس	نامگذاری واینر
RH1	D	RhO
RH2	C	¢rh
RH3	E	rh2
RH4	c	¢hr
RH5	e	hr2

 نظریه صحیح و رایج شیوه توارث سیستم ارهاش بر مبنای مدل تی‌پت (Tippett) است. در این مدل ژن‌های ارهاش در دو جایگاه یک و دو روی هر هاپلوتیپ کروموزوم یک قرار می‌گیرند.

ژن RHD در جایگاه یک و ژن RHCE در جایگاه دوم قرار می‌گیرد و از این رو به آن مدل دو جایگاهی تی‌پت گفته می‌شود.

ژن RHD تنها یک حالت یا یک آلل دارد و در صورت نبود ژن D حرف d در جای خالی D گذاشته می‌شود. توجه داشته باشید که d به مفهوم آنتی‌ژن d نیست، بلکه d به مفهوم نبود آنتی‌ژن D است.

بنابراین ژنوتایپ هر شخصی در جایگاه یک برای ژن D می‌تواند یکی از حالات DD (ژن D هم از پدر و هم از مادر به ارث رسیده است)، Dd (تنها یکی از والدین ژن D به ارث داده است) و dd (هیچکدام از والدین ژن D به ارث نداده‌اند) باشد.

جایگاه دوم که محل ژن RHCE است، دارای چهار آلل به نام‌های RHce و RHcE و RHCe و RHCE می‌باشد.  هر شخصی یکی از چهار حالت فوق را از پدر و یکی از مادر به ارث می‌برد. برای مثال RHce از پدر و RHCe از مادر و چنانچه والدین ژن D هم به ارث داده باشند، مدل تی‌پت به صورتRHD, RHCe/RHD, RHce در مورد این شخص نشان داده می‌شود.

پروتئین مارپیچی آنتی‌ژن‌های C و c شبیه بهم و در 4 اسید آمینه در موقعیت‌های 16 و 60 و 68 و 103 با هم تفاوت دارند. در میان این 4 اسید آمینه شماره 103 که در لوپ خارجی قرار دارد بسیار حائز اهمیت است. موقعیت 103 برای C اسید آمینه سرین و برای c اسید آمینه پرولین است (C/c ser103pro). مارپیچ پروتئینی آنتی‌ژن‌های E و c شبیه بهم و تفاوت در آمینو اسید 226 دارند. آنتی‌ژن E در این موقعیت دارای پرولین و آنتی‌ژن e دارای آلانین است (E/e pro226Ala). گفتنی است که آنتی‌ژن‌های C/c و E/e روی یک ساختار پروتئینی بوجود می‌آیند.

ژن‌های ارهاش کودومینان یا آنتی‌تتیکال هستند و این به مفهوم آن است که غالب و مغلوب وجود ندارند و ژن‌های به ارث رسیده به صورت هم‌غالب بیان می‌گردند. نظریه صحیح و رایج شیوه توارث سیستم ارهاش بر مبنای مدل تی‌پت (Tippett) است. در این مدل ژن‌های ارهاش در دو جایگاه یک و دو روی هر هاپلوتیپ کروموزوم یک قرار می‌گیرند.

فیشر و رایس یک مدل سه جایگاهی ارائه داده‌اند، بدین مفهوم که ژن‌های ارهاش در سه جایگاه بسیار نزدیک بهم قرار دارند. طبق این مدل در این جایگاه‌ها یکی از آلل‌های D/d، C/c و E/e روی هر هاپلوتیپ کروموزوم یک قرار می‌گیرد. برای مثال DCe از طرف مادر و dce از طرف پدر که در این حالت ژنوتایپ شخص DCe/dce گشته و آنتی‌ژن‌های D و C و c و e روی گلبول‌های قرمز بیان می‌شود.

واینر مدل تک جایگاهی ژنتیکی سیستم ارهاش ارائه می‌دهد و از نام‌گذاری Rh-hr استفاده می‌کند. واینر معتقد است که بیان ژن ارهاش موجب تولید یک آگلوتینوژن می‌شود که دارای فاکتورهای مختلف یا اپی‌توپ‌های مختلف است. با توجه به آلل‌های D/d و E/e و C/c می‌توان 8 هاپلوتیپ شایع در سیستم ارهاش را نوشت.

مثال: ژن R1 در نامگذاری واینر معادل ژن‌های DCe در نام‌گذاری فیشر و رایس و معادل ژن‌های RHDRHCe در نام‌گذاری تی‌پت است. برای آشنایی به معادل نام‌گذاری‌ها به جدول توجه فرمائید.

مثال دوم: اگر فردی هاپلوتایپ R1 از مادر و R1 از پدر به ارث برده باشد معادل ژنوتایپ آن در نام‌گذاری‌های ارهاش کدام است؟

نام‌گذاری واینر R1R1

نام‌گذاری فیشر و رایس DCe/DCe

نام‌گذاری تی‌پت RHD,RHCe/RHD,RHCe

گفتنی است که اصطلاح ارهاش مثبت و منفی تنها به حضور یا غیاب آنتی‌ژن D وابسته است. آنتی‌ژن D یا Rho در 85% افراد یافت شده که به آنها افراد ارهاش مثبت و در 15% وجود ندارد که به آنها افراد ارهاش منفی گویند. از ازدواج دو نفر با گروه مثبت ارهاش چه انتظاری در گروه فرزندان است؟

1-    DD × DD ® DD

2-    Dd × Dd ® DD, Dd, dd

3-    DD × Dd ® DD × Dd

اگر والدین برای ژن D هموزیگوت باشند (DD)، تمام فرزندان دارای ارهاش مثبت هستند. چنانچه والدین هتروزیگوت (Dd) باشند، فرزندان با گروه‌های مثبت و منفی امکان دارد.(توجه داشته باشید که حروف d به مفهوم نبود ژن D می‌باشد.)

در جدول شیوع ژنوتایپ‌های ارهاش ارائه شده است که بر مبنای آن می‌توان محتمل‌ترین ژنوتایپ را در والدین تخمین زد.

مثال: با استفاده از معرف‌های گروه‌ بندی سیستم ارهاش، فنوتیپ شخصی D+C+E-c-e+ است. با توجه به جدول ژنوتایپ R1R1 یا معادل آن DCe/DCe با توجه به شیوع هاپلوتایپ ها محتمل است. البته ژنوتایپ R1r¢DCe/Ce نیز ممکن است به احتمال کمتر مطرح گردد.

شیوع ژنوتایپ‌های شایع سیستم ارهاش

مثال: اگر پدر و مادر دارای گروه خون ارهاش مثبت باشند، ارهاش فرزندان چگونه است؟

ارهاش مثبت یا منفی تنها به حضور یا فقدان جایگاه شماره یک دارد.

ژنوتایپ‌های پدر DD or Dd®RH+® پدر

ژنوتایپ‌های مادر DD or Dd®RH+® مادر

کروموزوم یک دارای دو هاپلوتیپ است که یکی از پدر و دیگری از مادر به ارث می‌رسد. چنانچه والدین برای ژن D هموزیگوت باشند تمام فرزندان ارهاش مثبت خواهند بود، ولی چنانچه هر دو هتروزیگوت باشند گروه‌های مثبت و منفی امکان دارد.

مثال: اگر پدر و مادر گروه خون ارهاش منفی داشته باشد گروه ارهاش فرزندان چگونه است؟

dd  ژنوتیپ مادر

dd ژنوتیپ پدر

dd × dd ® dd فرزندان منفی

توجه داشته باشید که حرف d به مفهوم فقدان D است و بیانگر آنتی‌ژن d نمی‌باشد.

فنوتیپ ضعیف D (فنوتیپ Du یا D+w)

فنوتیپ Du یا آنتی‌ژن ضعیف D حدود یک درصد موارد ارهاش مثبت را شامل گردیده و با سه سازوکار ژنتیکی به شرح زیر شکل می‌گیرد:

1-  جهش‌هایی که منجر به بیان ضعیف آنتی‌ژن D می‌گردند. این فنوتیپ ضعیف شده ارهاش را فنوتیپ Du با درجه پائین (Low grade) گویند.

2-  قرار گرفتن ژن‌های D و C در وضعیت ترانس که موجب بیان ضعیف آنتی‌ژن D می‌گردد. این فنوتیپ ضعیف شده D را بنام‌های Du ترانس یا Du ناشی از تداخل ژنی یا Du با درجه بالا (High grade) گویند.

3-  جهش یا ترکیب ژنتیکی در جایگاه D که منجر به از دست دادن برخی از اپی‌توپ‌های آنتی‌ژن D گردد یا برخی از اپی‌توپ‌های جایگاه CE جایگزین اپی‌توپ‌های غایب D گردند.

این فنوتیپ ضعیف شده D را Du موزائیک گویند که بر خلاف دو گونه قبلی دارای اختلال کیفی در آنتی‌ژن D می‌باشد.

چنانچه خون ارهاش مثبت به فنوتیپ Du موزائیک تزریق شود امکان سنتز آنتی D علیه شاخص‌های غایب آنتی‌ژن D وجود دارد. نام دیگر Du موزائیک آنتی‌ژن D پارشیال است.

فنوتیپ Du در گونه اول و دوم (درجه پائین و بالا) یک اختلال کمی است که منجر به کاهش جایگاه‌های D در سطح گلبول می‌گردد.

ضعیف شدن آنتی‌ژن D در نوع درجه پائین غالباً به علت جهش‌هایی در اسید آمینه‌های مارپیچ پروتئینی ارهاش در قسمت‌های داخل غشایی یا سیتوپلاسمی است که منجر به کاهش انسجام یا جای گرفتن (insertion) تعداد کمتری از پروتئین‌های D روی سطح گلبول می‌گردد.

 فنوتیپ Du ممکن است ناشی از وجود ژن‌های C و D در موقعیت روبروی هم یا وضعیت ترانس باشد. برای مثال در ژنوتایپ CDe/Cde و یا cDE/Cde ژن‌های C و D روی هاپلوتیپ‌های جداگانه در روبروی هم یا وضعیت ترانس هستند. در این موارد ژن C موجب کاهش فعالیت ژن D شده و احتمالاً فراورده ژن C تعدادی از جایگاه‌های مربوط به D را پر می‌کند (steric hinderance) و از این رو منجر به ضعيف شدن آنتی ژن D می‌گردد، ولی تعداد جایگاه‌های D بیشتر از گونه Du با درجه پائین است.

در Du ترانس ژن C که روبروی D قرار می‌گیرد همراهی با ژن D ندارد. برای مثال ژنوتایپ cDE/CDe منجر به فنوتیپ Du ترانس نمی‌شود.

تعداد جایگاه‌های D در فنوتیپ Du با اختلال کمی بین 200 تا 10,000 تخمین زده می‌شود، در حالیکه مربوط به شخص ارهاش مثبت بین 15,000 تا 30,000 می‌باشد.

آنتی‌ژن D پارشیال (Partial D)

آنتی‌ژن D روی پروتئین‌های مارپیچ که 12 بار عرض غشای گلبول را طی می‌کنند بوجود می‌آید. هر مارپیچ آنتی‌ژن ارهاش، ایجاد 6 لوپ یا حلقه خارج سلولی می‌کند. شاخص‌های آنتی‌ژنی (اپی‌توپ) D روی لوپ‌های 3 و 4 و 6 قرار می‌گیرند. برای درک بهتر می‌توان هر اپی‌توپ آنتی‌ژن ارهاش را مانند سنگفرش موزائیک تصور کرد که آرایش شاخص‌های آنتی‌ژنی در کنار هم آنتی‌ژن D را شکل می‌دهد و از اینرو گاهی به D پارشیال، D موزائیک گفته می‌شود.

اگر آنتی‌ژن D دارای برخی از اپی‌توپ‌ها نباشد (Missing epitopes)، به آن D ضعیف شده یا Du از گونه موزائیک گویند و در این حالت فرد ممکن است علیه شاخص‌ها یا اجزای سنگفرشی غایب آنتی‌ژن D آلوآنتی‌بادی بسازد و از اینرو فرد ارهاش مثبت دارای آنتی D گردد.

افراد Du موزائیک دهنده مثبت و گیرنده منفی هستند، ولی چون نمی‌توان انواع Du را در آزمایشگاه از هم جدا کرد از این رو قانون دهنده مثبت و گیرنده منفی برای تمام انواع Du از نظر عملی استفاده می‌شود.

تزریق خون RH مثبت به Du موزائیک ممکن است موجب تولید آنتی‌بادی علیه اپی‌توپ‌های غایب گردد و گفتنی است که حتی دو نفر با فنوتیپ‌های Du موزائیک ممکن است در اپی‌توپ‌های غایب با هم تفاوت داشته باشند و در تزریق خون به یکدیگر علیه اپی‌توپ‌های مورد تفاوت آنتی‌بادی بسازند.

فنوتیپDu موزائیک برخلاف انواع دیگر Du یک اختلال کیفی است. گاهی به جای اپی‌توپ‌های غایب D، پروتئین‌های جایگاه RHCE قرار گرفته و یک حالت نوترکیبی ژنتیکی (genetic recombination) بین قسمت‌هایی از ژن RHD و ژن RHCE ایجاد می‌شود.

آنتی‌ژن  (RH12) G

آنتی‌ژن G یکی از آنتی‌ژن‌های ارهاش است که بر روی گلبول‌های قرمز C+ یا D+ یافت می‌گردد. گفتنی است که ژن‌های RHD و RHCE هر کدام دارای 10 اگزون بوده و اگزون شماره 2 ژن‌های C و D با هم مشابه است و از اینرو آنتی‌ژن G فصل مشترک آنتی‌ژن‌های C و D است. آنتی‌ژن G در ارتباط با اسید آمینه سرین در موقعیت 103 است (Ser103) است.

در تزریق گلبول‌های قرمز C+ به افراد ارهاش منفی (D-) ممکن است علاوه بر آنتی‌C آنتی G هم تولید شود. آنتی G ویژگی آنتی C+D دارد. آنتی G حائز اهمیت بالینی بوده و قادر به عبور از جفت می‌باشد. چنانچه بیماری دارای آنتی G باشد، بایستی خون ارهاش منفی به وی تزریق شود. بیشتر مثال‌های آنتی G همراهی با آنتی D دارد.

اگر در سرم یک خانم حامله با گروه ارهاش منفی آنتی G وجود داشته باشد، بایستی از آنتی D و آنتی C واقعی افتراق داده شود. اگر آنتی G موجود باشد، هنوز احتمال تحریک مادر توسط شاخص‌های آنتی‌ژن D وجود داشته و بایستی به مادر روگام تزریق گردد، در صورتی که وجود آنتی D واقعی در مادر او را از تزریق روگام معاف می‌کند. با روش جذب والوشن می‌توان آنتی G را از آنتی C و D جدا کرد، ولی یک نشانه برای شناسایی آنتی G واکنش قوی‌تر و عیار بالاتر آن با گلبول‌های C+ است. عیار آنتی C حداقل 4 برابر عیار آنتی D است. اگر آنتی D و آنتی C واقعی در سرم باشد، الگوی واکنش بر عکس بوده و عیار آنتی‌D بالاتر از آنتی C خواهد بود.

آنتی‌ژن‌های با شیوع کم در سیستم ارهاش

آنتی‌ژن‌های با شیوع کم ارهاش که در حدود 1% جمعیت رخ می‌دهد شامل Cw و Cx و RH32 می‌باشند. آنتی‌ژن‌های Cw و Cx در نتیجه جهش در اگزون شماره یک و تغییر یک اسید آمینه در نخستین لوپ پروتئینی RHCe می‌باشند.

سندرم ارهاش نول (RH null syndrome)

فقدان کلی آنتی‌ژن‌های ارهاش بر روی گلبول‌های قرمز را سندرم ارهاش نول گویند که با مرفولوژی استوماتوسیت و اسفروسیت و کم‌خونی مزمن همولیتیک جلوه می‌کند. این پدیده بیانگر آن است که پروتئین‌های ارهاش در انسجام غشاء نقش دارند. شیوع سندرم ارهاش نول کمتر از 1 به 6,000,000 می‌باشد.

سندرم ارهاش نول به دو گونه رگولاتوری و آمورف به ارث می‌رسد. در گونه رگولاتوری فقدان یا جهش در ژن RHAG رخ داده و پروتئین‌های ارهاش با وجود ژن‌های ارهاش نمی‌توانند در غشای گلبول قرمز جای گیرند.

در گونه آمورفیک هر چند ژن RHAG فعال است، ولی حذف ژن D و جهش در ژن RHCE موجب فقدان کلی آنتی‌ژن‌های ارهاش می‌گردند. در این حالت پروتئین‌های RHAG به میزان کمتری نسبت به حالت طبیعی روی غشاء وجود دارند.

حالتی دیگر به نام RH mod ناشی از جهش در ژن RHAG با قدرت سنتز کم گزارش گردیده است که کاهش RHAG موجب بیان ضعیف آنتی‌ژن‌های ارهاش می‌گردد.

کم‌خونی مزمن همولیتیک با مرفولوژی استوماتوسیت و اسفروسیت در سندرم‌های ارهاش نول و مد (RH mod) مشاهده می‌گردد. ساخت آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن‌های شایع ارهاش در سندرم ارهاش نول رخ داده و چنانچه فرد مبتلا دارای آنتی‌بادی علیه Rh29 که به آن آنتی‌بادی علیه ارهاش کامل (Antitotal RH) گویند گردد، در صورت نیاز به خون بایستی از خون ارهاش نول استفاده کرد.

سیستم ارهاش در تزریق خون

آنتی‌ژن D یک آنتی‌ژن قوی به غیر از آنتی‌ژن‌های ABO در میان سایر گروه‌های خون است. ترتیب ایمونوژنسیته یا تحریک کنندگی ایمنی به صورت D>c>E>C>e می‌باشد. حدود 80% افراد ارهاش منفی با تزریق 250 سی‌سی خون ارهاش مثبت و حدود 50% با تزریق حجم اندک (حدود یک سی‌سی) تحریک شده و آنتی D می‌سازند.

برای جلوگیری از تحریک سنتز آنتی D از آمپول روگام استفاده می‌شود. روگام (RhIG) یا ایمونوگلوبولین ارهاش از جنس آنتی D و از کلاس IgG است. روگام را بایستی تا 72 ساعت پس از تزریق خون ارهاش مثبت به بیمار ارهاش منفی تزریق کرد. روگام با سرکوب ایمنی و پوشش آنتی‌ژن‌های D مانع از سنتز فعال آنتی D می‌گردد. نیمه عمر روگام 21 روز می‌باشد. هر آمپول روگام حاوی 300 میکروگرم برای تزریق عضلانی و یا 1500 واحد اینترناسیونال برای تزریق وریدی است. هر 20 میکروگرم روگام جهت جلوگیری از ایمونوزاسیون یک سی‌سی گلبول قرمز فشرده به کار می‌رود، از اینرو هر آمپول برای جلوگیری از تحریک 30 سی‌سی خون کامل یا 15 سی‌سی خون فشرده است. در تزریق وریدی روگام بایستی 90 واحد اینترناسیوال (IU) به ازای تزریق هر سی‌سی گلبول قرمز ارهاش مثبت به منفی تزریق شود.

مثال: اگر به بیماری با گروه منفی 200 سی‌سی خون کامل ارهاش مثبت تزریق شود، به چند آمپول روگام نیاز است؟

8 ® 7= 6/6 = 30 ¸ 200

در محاسبه روگام اگر اعشار 0/5 یا بیشتر بود به طرف عدد بالا گرد کرده و یک عدد هم اضافه می‌شود، ولی چنانچه عدد اعشاری کمتر از 0/5 باشد فقط به طرف عدد بالاتر گرد می‌شود.

نکته‌های مهم

•  بیماران ارهاش منفی بایستی خون ارهاش منفی دریافت کنند، مگر در موارد اورژانس که دسترسی به خون ارهاش منفی میسر نبوده و یا بیمار احتیاج به تزریق تعداد زیادی کیسه‌های خون دارد و تزریق گروه مثبت اجتناب ناپذیر است.

•  چنانچه بیمار ارهاش منفی که خون ارهاش مثبت دریافت کرده دختر یا خانم جوان باشد می‌توان برای جلوگیری از تحریک ارهاش و جلوگیری از بروز کم‌خونی همولیتیک جنین-نوزادی از تزریق روگام استفاده کرد.

•  تزریق خون ارهاش مثبت به منفی در بار اول موجب همولیز فوری نمی‌شود و چنانچه آنتی‌بادی علیه ارهاش تولید گردد همولیز شدید داخل عروقی رخ نمی‌دهد. آنتی‌بادی‌های ارهاش، قادر به فعال کردن کمپلمان نبوده و از اینرو همولیز از نوع خارج عروقی مشاهده می‌گردد.

•  آزمایش کراس مچ یا آزمایش سازگاری، اشتباه در گروه‌بندی ارهاش را مشخص نمی‌کند، مگر اینکه بیمار از قبل دارای آنتی‌بادی علیه ارهاش باشد. گفتنی است که بیشتر اشتباهات گروه‌بندی ABO در آزمایش کراس‌مچ آشکار می‌شود.

•  چنانچه بیماری در سرم دارای آنتی c یا آنتی e باشد، برای تزریق در صورت امکان از خون ارهاش مثبت استفاده کنید. چون خون ارهاش منفی اکثراً دارای ژنوتایپ ce/ce می‌باشد، در حالیکه خون ارهاش مثبت با شیوع کمتری دارای آنتی‌ژن‌های cو e می‌باشد.

•  بیماران (CDe/CDe) R1R1 در خطر ایجاد آنتی E و آنتی c با تزریق خون هستند و از اینرو برخی از مراکز انتقال خون به این بیماران خون R1R1 می‌دهند. با توجه به ژنوتایپ و سابقه تزریق خون می‌توان تشخیص احتمالی نوع آنتی‌بادی را داد. فنوتیپ R1R1 دارای شیوع فراوان است.

•  در بیماری که دارای آنتی‌بادی‌های E یا C یا D باشد برای تزریق از خون ارهاش منفی استفاده کنید، چون خون ارهاش منفی غالباً دارای فنوتیپ ce می‌باشد.

ویژگی‌های آنتی‌بادی‌های سیستم ارهاش در سرم

1- آنتی‌بادی‌های سیستم ارهاش از جنس IgG1 و IgG3 یا مخلوطی از هر دو می‌باشد. آنتی‌بادی‌ها دارای توانایی عبور از جفت و قادر به آغشته کردن گلبول‌های قرمز ارهاش مثبت جنین و نوزاد بوده که کم‌خونی همولیتیک جنین- نوزادی را به دنبال دارد. در برخی موارد آنتی‌بادی از جنس IgM و IgA گزارش شده است.

2- آنتی‌بادي‌های ارهاش در نتیجه تحریک ایمنی در اثر حاملگی و تزریق خون رخ می‌دهند، امکان دارد آنتی E و آنتی Cw به صورت رخداد طبیعی و غیر ایمیون رخ دهد.

3- آنتی‌بادی‌های ارهاش سیستم کمپلمان را فعال نمی‌کنند و گمان می‌رود دوری فاصله آنتی‌ژن‌ها از یکدیگر عامل این پدیده باشد.

4- آنتی‌بادی‌های ارهاش خاصیت اثر دوزاژ دارند. برای مثال آنتی D در سرم با گلبول‌های هموزیگوت (DD) D واکنش بهتری نسبت به هتروزیگوت (Dd) D می‌دهد.

5- مجاورت گلبول‌های قرمز با آنزیم موجب تشدید واکنش آنتی‌ژن‌های ارهاش با آنتی ارهاش می‌گردد.

6- سیستم ارهاش هدف تولید آتوآنتی‌كرهای گرم در کم‌خونی‌های اتوایمون و کم‌خونی‌های همولیتیک ناشی از مصرف داروست. آنتی e در بسیاری از موارد گزارش شده است.

تفاوت‌های سیستم ABO از سیستم ارهاش (سیستم‌های کاربوهیدراته از سیستم‌های پروتئینی)

• شاخص آنتی‌ژن‌های سیستم‌های گروه خونی ABO، لوئیس، Ii و P روی ترکیبات قندی بنا می‌شود، در صورتی که مربوط به ارهاش روی پروتئین شکل می‌گیرد.

• فقدان آنتی‌ژن‌های ABO روی مرفولوژی گلبول‌های قرمز اثری ندارد، حتی افراد “O” بمبئی دارای گلبول‌های قرمز با مرفولوژی طبیعی هستند، در حالیکه فقدان کامل آنتی‌ژن‌های ارهاش با مرفولوژی استوماتوسیت، فقدان سیستم کل (Kell) با مرفولوژی اکانتوسیت و فقدان گربیچ با مرفولوژی الیپتوسیت همراه است.

• آنتی‌ژن‌های ABO به وفور در سطح گلبول قرمز یافت می‌شوند، برای مثال جایگاه‌های آنتی‌ژنی گروه خون A روی هر گلبول قرمز حدود یک میلیون است، درحالیکه مربوط به آنتی ژن D از سیستم ارهاش بین 10,000 تا 30,000 برآورد می‌شود.

• آنتی‌ژن‌های ABO روی همه سلول‌های بدن و در 85% افراد در همه ترشحات بدن (احتمالاً بجز مایع مغزی) وجود دارد، در حالیکه آنتی‌ژن‌های ارهاش محدود به گلبول‌های قرمز است.

• آنتی‌بادی‌های سیستم ABO دارای رخداد طبیعی (Naturally occurring) است. آنتی A و آنتی B غالباً از جنس IgM با قدرت آگلوتیناسیون قوی هستند و توانایی فعال کردن کمپلمان را دارند. تزریق خون ناسازگار از نظر ABO موجب همولیز درون عروقی و نارسایی حاد کلیه می‌گردد.

• آنتی‌بادی‌های سیستم ارهاش غالباً تحریکی و در نتیجه ورود آنتی‌ژن در حاملگی و یا تزریق خون شکل می‌گیرند. آنتی‌بادی‌ها غالباً از جنس IgG بوده و قابلیت عبور از جفت را دارند.

• سیستم‌های گروه خونی لیپمن (LIPMAN) با علامت L برای لوئیس، I برای سیستم I و P برای گروه P و MN برای سیستم MN و A برای سیستم ABO دارای آنتی‌بادی‌های با رخداد طبیعی هستند. فقدان هر آنتی‌ژن همراه با حضور آنتی‌بادی علیه آن آنتی‌ژن است. برای مثال در نبود آنتی‌ژن P1 شخص دارای آنتی P1 و در نبود آنتی‌ژن N شخص دارای آنتی N و نبود A شخص دارای آنتی A است.

انواع معرف‌های آنتی D برای گروه‌بندی

1- آنتی D پلی‌کلونال از جنس IgG با منبع انسانی در محیطی ماکرومولکولار با غلظت پروتئینی زیاد.

2- آنتی D از جنس IgG با تعدیل شیمیائی.

3- آنتی D از جنس IgM با قابلیت واکنش در محیط سرم فیزیولوژی.

4- آنتی D منوکلونال با مخلوط منوکلونال IgM و پلی‌کلونال IgG از منبع انسانی.

5- آنتی D منوکلونال با مخلوط IgM و IgG منوکلونال.

گروه‌بندی ارهاش روی اسلاید

روش کار:

1- یک قطره آنتی D روی اسلاید تمیز بریزید.

2- یک قطره کنترل مناسب روی اسلاید دیگر ریخته و نشانه‌گذاری کنید.

3- به هر اسلاید دو قطره از سوسپانسیون 40 تا 50% گلبول قرمز در سرم یا پلاسما اضافه کنید.

4- با اپلیکاتور کاملاً مخلوط کرده و در صورت نیاز اسلایدها را روی جعبه ارهاش قرار دهید و بعد از دو دقیقه واکنش را قرائت کنید.

چند نکته مهم:

• آنتی D با غلظت پروتئین بالا و مواد ماکرومولکولار احتیاج به کنترل با غلظت پروتئینی 20 تا 24 درصد دارد. در صورت نبود محلول کنترل از کارخانه سازنده می‌توان حداقل از آلبومین 22 تا 30% استفاده کرد. گروه‌ بندی ارهاش هنگامی اعتبار دارد که اسلاید کنترل منفی شود. مثبت شدن اسلاید کنترل به مفهوم واکنش رولکس یا احتمال گلبول‌های آغشته به آنتی‌کر می‌باشد.

• آنتی D پلی‌کلونال از جنس IgG انسانی برای واکنش بهتر احتیاج به جعبه ارهاش (viewbox) دارد. جعبه ارهاش بایستی همیشه روشن باشد تا در سطح خود حرارت 50-45 درجه تولید کند. اسلاید را روی جعبه گذاشته و با حرکت مداوم آن نتیجه واکنش در دو دقیقه قرائت می‌شود.

• چنانچه خون بیمار رقیق باشد، می‌توان با سانتریفوژ مقداری پلاسما را برداشت و سوسپانسیون گلبولی را برای گروه‌بندی ارهاش در سطح 40 تا 50% تنظیم کرد.

• آنتی D از نوع منوکلونال احتیاج به جعبه ارهاش و کنترل با 22 درصد آلبومین ندارد.

گروه‌بندی ارهاش با روش لوله‌ای

1- یک قطره آنتی D در یک لوله تمیز بریزید و نشانه‌گذاری لوله تست کنید.

2- یک قطره از کنترل مناسب در لوله دیگر ریخته و نشان کنترل بگذارید.

3- به هر لوله یک قطره از سوسپانسیون 2 تا 5% گلبول‌های قرمز (در سرم فیزیولوژی یا در سرم یا در پلاسما) اضافه و مخلوط کنید.

4- لوله‌ها را بمدت 30 ثانیه با دور 3000 در دقیقه یا g1000-900 سانتریفوژ کنید.

5- لوله را ملایم تکان داده و برای واکنش بررسی کنی

تفسیر: آگلوتیناسیون در لوله تست و واکنش منفی در لوله کنترل بیانگر فنوتیپ ارهاش مثبت است. منفی شدن واکنش در هر دو لوله بیانگر ارهاش منفی یا فنوتیپ Du است. اگر گروه خون مربوط به بیماری است که نیاز به تزریق خون دارد، انجام آزمایش تا مرحله 5 کافی بوده و با توجه به الگوی واکنش گروه ارهاش را گزارش کنید. اگر گروه خون مربوط به اهدا کننده است با مشاهده واکنش منفی بایستی آزمایش Du را انجام داد.

آزمایش Du

اصول آزمایش

گلبول‌های قرمز با فنوتیپ Du در مجاورت با آنتی D آگلوتینه نمی‌دهند، بلکه واکنش آنتی ژن- آنتی بادی به صورت آغشتگی (coating) است. اثبات آغشتگی گلبول‌های قرمز با آنتی D به مفهوم فنوتیپ Du است، که برای این منظور از آنتی‌هیومن گلبولین با ویژگی ضد Fc مولکول IgG استفاده می‌شود. آنتی هیومن گلبولین با اتصال به مولکول‌های Fc بین گلبول‌های قرمز آغشته شده به آنتی‌کر پل زده و آنها را آگلوتینه می‌کند.

روش کار: ( توجه: برای مشاهده بهتر واکنش می‌توان حجم‌هایی که در اینجا ذکر شده را 2 برابر کنید. )

1- یک قطره آنتی D از جنس IgG یا مخلوط IgG و IgM را در یک لوله آزمایش بریزید.

2- یک قطره محلول کنترل مناسب را در لوله دیگر ریخته و نشانه‌‌ گذاری کنید.

3- به هر لوله یک قطره از سوسپانسیون 2 تا 5% گلبول‌های قرمز در سرم فیزیولوژی اضافه و مخلوط کنید.

4- لوله‌ها را به مدت 15 تا 30 دقیقه در 37 درجه انکوبه کنید و پس از آن با دور 3000 در دقیقه یا g1000-900 برای 30 ثانیه سانتریفوژ کنید.

5- با مشاهده آگلوتیناسیون قوی گروه خون را ارهاش مثبت گزارش کنید و احتیاج به مراحل بعدی ندارد. لوله کنترل بایستی منفی باشد.

6- در صورت مشاهده واکنش منفی یا مشکوک در لوله تست آن را 3 الی 4 بار با سرم فیزیولوژی شسته و در مرحله آخر شستشو بعد از دور ریختن سرم فیزیولوژی با واژگون کردن لوله آزمایش روی پارچه گاز آخرین قطرات سرم فیزیولوژی را جذب گاز کنید.

7- یک تا دو قطره آنتی هیومن گلبولین را به لوله آزمایش اضافه کرده و بمدت 15 ثانیه سانتریفوژ کنید.

8- لوله را باتکان دادن ملایم برای آگلوتیناسیون مشاهده کنید. مشاهده واکنش آگلوتیناسیون به مفهوم فنوتیپ Du است.

9- چنانچه واکنش منفی بوده و از کارآیی آنتی هیومن گلبولین مطمئن هستید، جواب را ارهاش منفی گزارش کنید.

چند نکته:

1- انجام تست Du برای تمام اهدا کنندگان خون که در مرحله تست فوری با آنتی D جواب منفی می‌دهند لازم است.

2- انجام تست Du برای نوزادی که مادر دارای گروه ارهاش منفی است لازم است. با مثبت شدن ارهاش یا فنوتیپ Du در نوزاد، مادر کاندیدای تزریق روگام است.

3- برای بیماران احتیاجی به انجام تست Du نیست.

4- محلول کنترل برای آنتی D با مواد ماکرومولکول محلول شاهد کارخانه سازنده یا آلبومین 22 تا 30% و برای آنتی D در محیط با وزن مولکولی کم آلبومین 6 درصد است.

گفتنی است که برخی از انواع آنتی D منوکلونال قادر به آگلوتیناسیون مستقیم برخی از انواع فنوتیپ Du هستند و تعجبی ندارد که فردی که قبلاً با استفاده از آنتی D نوع انسانی گروه‌بندی منفی شده است، هم اکنون ارهاش مثبت گزارش شود.