آنالیز اسپرم- ۴

 

 

روش کار روتین برای شمارش اسپرم

در اکثر موارد رقت ۵/۱ یا ۲۰/۱رقت مناسبی بوده و با آن می‌توان ۲۰۰ اسپرم را در یک یا چند مربع از لام نئوبار (مربع‌های ۴ و ۵ و ۶) شمارش نمود. برای تعیین رقت مناسب، ابتدا یک لام مستقیم تهیه نموده و با بزرگنمایی ۲۰۰ یا ۴۰۰ تعداد اسپرم‌های هر میدان میکروسکوپی را می‌شماریم. در صورتی که در لام مستقیم هیچ اسپرمی دیده نشود، یک لام دیگر تهیه می‌کنیم.

نکته: اگر لام مستقیمی را با بزرگنمایی ۴۰۰ بررسی کنیم ، هر میدان میکروسکوپی حدود ۴ نانولیتر (nL) حجم خواهد داشت.اگر در این میدان میکروسکوپی ۱۰۰ اسپرم دیده شود، در هر نانولیتر ۲۵ اسپرم خواهیم داشت و در نتیجه تعداد اسپرم‌هاmL / ۲۵×۱۰۳  یاmL / ۲۵ ×۱۰۶ خواهد بود. البته این برآورد دقیق نیست و می‌تواند بین 30‌% تا ۱۳۰‌% مقدار واقعی باشد.

در نمونه‌هایی که ویسکوزیته زیادی دارند،استفاده از ملانژور سفید برای رقیق کردن مایع منی باعث بروز خطا می‌شود. اگر در رقتی که تهیه شده تعداد کمی اسپرم دیده شد، نمونه‌ دیگری با رقت کمتر تهیه می‌کنیم و اگر تعداد اسپرم‌ها خیلی زیاد بود و اسپرم‌ها روی هم افتاده بودند، نمونه‌ دیگری با رقت بیشتر تهیه می‌کنیم .

a) روش رقیق کردن اسپرم

ـ در داخل دو لوله مقدار مورد نیاز از محلول رقیق‌‌کننده اسپرم (فیکساتیو) می‌ریزیم.

ـ نمونه را به خوبی مخلوط کرده و مقدار مورد نیاز از مایع منی را با سمپلر برمی‌داریم. اطراف سرسمپلر را تمیز کرده (بدون اینکه با سر آن تماس برقرار شود) و آن را داخل لوله حاوی محلول رقیق‌کننده خالی می‌کنیم. سمپلر را چند بار پر و خالی نموده تا نمونه کاملاً تخلیه شود.

ـ به روش ذکر شده در لوله‌ای دیگر نیز یک نمونه رقیق شده تهیه می‌کنیم.

ـ لوله اول را به مدت ۱۰ثانیه با ورتکس مخلوط کرده و سریعاً ۱۰µL از آن را برمی‌داریم.

ـ لامل نئوبار را روی لام نئوبار می‌گذاریم. برای اینکه لامل به خوبی روی لام بچسبد، بهتر است لبه‌های آن را کمی مرطوب کنیم. لام نئوبار دو قسمت برای شمارش دارد که هر طرف را با یکی از لوله‌های رقیق شده پر می‌کنیم.

ـ سر سمپلر را به کناره لامل چسبانده و آن را خالی می‌کنیم. باید توجه داشت که هنگام تخلیه لامل حرکت نکند و فضای زیر لامل نیز کمتر یا بیشتر از حد پر نشود.

ـ طرف دیگر لام نئوبار را هم با لوله دوم به روش فوق‌الذکر پر می‌کنیم.

ـ لامها را حداقل به مدت ۴ دقیقه در یک محیط مرطوب (مثلاً داخل یک پلیت که حاوی قطعه‌ای کاغذ صافی مرطوب است) قرار می‌دهیم تا سلول‌ها ثابت شوند.

b) روش شمارش اسپرم:

شمارش اسپرم را در دو طرف لام نئوبار انجام می‌دهیم. اگر این جواب‌ها همخوانی داشته باشند، نتیجه را گزارش کرده و در غیر این صورت آزمایش را تکرار می‌کنیم. برای شمارش، مربع مرکزی (شماره ۵) را انتخاب می‌کنیم. این مربع ۵ ردیف افقی دارد که حجم هر ردیف ۲۰ نانولیتر است. ابتدا از یک ردیف شروع می‌کنیم و اسپرم‌ها را می‌شماریم. این‌کار را آنقدر ادامه می‌دهیم تا ۲۰۰ اسپرم شمارش شود. اگر در ردیف اول به عدد ۲۰۰ نرسیدیم، ردیف‌های بعدی را می‌شماریم تا ۲۰۰ اسپرم راشمارش نماییم. البته اگر در وسط یک ردیف به عدد ۲۰۰ برسیم شمارش را تا انتهای آن ردیف ادامه می‌دهیم. تعداد ردیف‌ها و اسپرم‌های شمارش شده را یادداشت می‌کنیم (مثلاً ۲۲۶ اسپرم در ۴ ردیف) . مربع‌های ۴ و 6 (دو طرف مربع مرکزی) نیز هر کدام ۵ ردیف افقی دارند. اگر در کل مربع مرکزی نتوانستیم ۲۰۰ اسپرم را بشماریم از مربع‌های ۴ و ۶ استفاده می‌کنیم و کل ردیف‌های شمارش شده را یادداشت می‌کنیم. وقتی شمارش تکمیل شد، به طرف دیگر لام نئوبار رفته و اسپرم‌ها را در همین تعداد ردیف می‌شماریم. تعداد اسپرم‌های شمارش شده در دو طرف لام را با هم جمع کرده و اختلاف آن‌ها را نیز حساب می‌کنیم. این اختلاف باید مساوی یا کمتر از مقدار قابل قبولی باشد که در جدول ۴‌-‌۲ آمده است. در صورتی که اختلاف بیشتر باشد، عمل رقیق‌ سازی و شمارش مجددا” تکرار می‌شود.

در صورتی که اختلاف دو شمارش در محدوده قابل قبول بود، از فرمول زیر تعداد اسپرم‌ها را محاسبه می‌کنیم:

۱۰۶×ضریب رقت×    ۱/۲۰  ×N/n  (C) =تعداد اسپرم‌ها در هر میلی‌لیتر

N عبارت است از تعداد کل اسپرم‌های شمارش شده در دو طرف لام نئوبار

nعبارت است از تعداد کل ردیف‌هایی که اسپرم‌هادر آن‌ها شمارش شده‌اند (در دو طرف لام نئوبار)

به دو مثال زیر توجه کنید:

مثال اول:نمونه ای را ۱/۲۰ رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار ۲۰۱ اسپرم را در هفت ردیف شمرده‌ایم و در طرف دیگر ۲۴۵ اسپرم را در همین تعداد ردیف شمارش نموده‌ایم. مجموع این دو شمارش ۴۴۶ و اختلاف آنها ۴۴ است. با توجه به جدول 4‌-‌۲‌ این اختلاف بیش از محدوده قابل قبول بوده و لذا باید مجدداً نمونه را رقیق کرده و شمارش را تکرار نماییم.

مثال دوم: نمونه‌ای را رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار ۲۲۰ اسپرم را در چهار ردیف شمارش کرده‌ایم و در طرف دیگر ۲۱۸ اسپرم را در همین تعداد ردیف شمرده‌ایم. حاصل جمع این دو شمارش در هشت ردیف ۴۳۸ و اختلاف آنها ۲ می‌‌باشد. این اختلاف با توجه به جدول 4‌-‌۲‌ در محدوده قابل قبول است. برای محاسبه غلظت اسپرم از رابطه زیر استفاده می‌کنیم:

C = 8 × ۱/۲ × ۲۰ × ۱۰۶ = 55×۱۰۶ /mL

نکته: اگر در سه مربع ۴ و ۵ و ۶ مجموعا”کمتر از ۲۰۰ اسپرم شما رش شد، نباید از مربع‌های دیگر استفاده کرد زیرا حجم ردیف‌های این سه مربع با مربع‌های دیگر متفاوت است. در این موارد باید مجددا” نمونه ای با رقت کمتر تهیه نموده و شمارش را تکرار نماییم و یا حداقل میزان خطا را با توجه به جدول ۲-۲ برای پزشک گزارش نماییم.

مثال: نمونه‌ای را 1/۲۰ رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار ۹۸ اسپرم را در ۱۵ ردیف (کل مربع‌های ۴ و ۵ و ۶) و در طرف دیگر ۱۱۴ اسپرم را در همین حجم شمارش کرده‌ایم. کار صحیح آن است که رقت را کمتر کرده و مجدداً شمارش را انجام دهیم، ولی اگر بخواهیم همین شمارش را ارائه کنیم به طریق زیر عمل می‌کنیم:

چون حاصل جمع ۲۱۲ و اختلاف آنها ۱۵ است، این اختلاف در حداقل قابل قبول است و لذا:

C = 212/30 × ۱/۲۰ × ۲۰ × ۱۰۶ = 7.۱ × ۱۰۶

با توجه به این، میزان خطا برای ۲۱۲ اسپرم تقریباً برابر ۷‌% می‌باشد.

مقادیر مرجع: کمترین حد مرجع برای غلظت اسپرم ۱۰۶×۱۵ در هر میلی‌لیتر است.

محاسبه تعداد کل اسپرم‌ها: از حاصل ضرب حجم مایع منی در غلظت اسپرم، تعداد کل اسپرم‌های یک فرد محاسبه می‌شود. این عدد بیانگر توانایی بیضه‌ها در تولید اسپرم است. کمترین حد مرجع برای تعداد کل اسپرمهای یک فرد ۱۰۶×۳۹ در هر انزال است.

کریپتوزواسپرمی Cryptozoospermia و آزواسپرمی  azoospermia

اگر در لام مستقیم هیچ اسپرمی دیده نشود، وجود آزواسپرمی محتمل است. زمانی می‌توان اصطلاح آزواسپرمی را به کار برد که در نمونه سانتریفوژ شده، مایع منی هیچ اسپرمی دیده نشود. با این حال شاید اطلاق واژه آزواسپرمی به سادگی امکان‌پذیر نباشد، زیرا حتی سانتریفوژ کردن در دور ۳۰۰۰ به مدت ۱۵ دقیقه هم ممکن است برخی از اسپرم‌ها را رسوب ندهد ضمن اینکه کل رسوب را هم بررسی نمی‌کنیم و ممکن است در بخشی از رسوب که بررسی نشده اسپرمی وجود داشته باشد. با این حال وقتی در لام مستقیم اسپرمی دیده نشد، نمونه را ۱۵ دقیقه در دور ۳۰۰۰ سانتریفیوژ می‌کنیم، محلول رویی را خالی کرده و رسوب را بررسی می‌کنیم. اگر اسپرمی دیده نشد، به آن آزواسپرمی می‌گوییم و اگر اسپرم دیده شد، اصطلاحاً به آن کریپتوزواسپرمی اطلاق می‌کنیم.

زمانی که در لام مستقیم با بزرگنمایی ۴۰۰ تعداد کمی اسپرم دیده شود (۰ تا ۴)، تعداد اسپرم‌ها تقریباً کمتر از /mL 106×۲ است. در برخی از موارد همین گزارش (علی‌رغم خطایی که دارد) برای ارزیابی بالینی بیمار کافی است، اما در حداکثر موارد باید تعداد دقیق اسپرم‌ها شمارش شود. برای این‌کار نمونه را به نسبت   ۱/۲   رقیق می‌کنیم و هر ۹ مربع بزرگ لام نئوبار را بررسی می‌کنیم تا ۲۰۰ اسپرم شمارش شود. تعداد دقیق مربع‌هایی که در آن‌ها ۲۰۰ اسپرم را شمرده‌ایم یادداشت نموده و در طرف دیگر لام نئوبار نیز این شمارش را انجام می‌دهیم. با استفاده از جدول 5‌-‌۲‌ مشخص می‌نمائیم که آیا اختلاف دو شمارش در محدوده قابل قبول است یا خیر. اگر این اختلاف قابل قبول نبود، مجدداً آزمایش را تکرار کرده و در صورتی که قابل قبول باشد، غلظت را از فرمول زیر محاسبه می‌کنیم:

ضریب رقت   C = N/n × 1/۱۰۰ × 106    

N= تعداد اسپرمهای شمارش شده

n = تعداد مربع‌هایی که شمارش در آنها انجام شده است

جدول ۵‌–‌۲‌ میزان اختلاف قابل قبول بین دو بار شمارش اسپرم در مواردی که تعداد اسپرم‌ها پایین است. اگرمجموعا” کمتر از ۴۰۰ اسپرم در هر دو طرف لام نئوبار شمارش شود، با استفاده از جدول 2-۲ میزان خطای کار را همراه نتیجه بیمار گزارش می‌کنیم. اگر رقت ۱/۲ باشد و کمتر از ۲۵ اسپرم در هر طرف لام نئوبار شمارش شود، غلظت اسپرم کمتر از ۵۶۰۰۰ در میلی لیتر بوده ومیزان خطا ۲۰% است (جدول ۲-۲).

دراین حالت ذکر جمله زیر درجواب بیمار ضروری است :

«تعداد اسپرم مشاهده شده کمتر از مقداری است که بتوان جواب صحیح برای بیمار گزارش نمود.»

به مثال‌های زیر توجه کنید:

مثال اول: نمونه‌ای را ۱/۲ رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار ۲۰۰ اسپرم در دو مربع شمارش شده و در طرف دیگر ۲۵۰ اسپرم را در همین تعداد مربع شمارش نموده‌ایم. مجموع دو شمارش در ۴ مربع برابر با ۴۵۰ و تفاوت آن‌ها ۵۰ است. با توجه به جدول 5‌-‌۲‌ این رقم بیش از اختلاف قابل قبول است و لذا باید مجددا” رقت تهیه کرده و آزمایش را تکرار کنیم.

مثال دوم: نمونه‌ای را رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار ۲۱۰ اسپرم در سه مربع شمارش شده و در طرف دیگر ۲۰۰ اسپرم را در همین تعداد مربع شمارش نموده‌ایم. مجموع دو شمارش در ۶ مربع برابر ۴۱۰ و تفاوت آنها ۱۰ است.

با توجه به جدول ۵‌-‌۲‌ این تفاوت قابل قبول است. برای محاسبه غلظت از رابطه زیر استفاده می‌کنیم:

C = 1/100 × ۴۱۰/۶ × ۴×۱۰۶= ۲×۱۰۶     

C = 1/100 ×  ۲۶۰/۱۸ × ۲ × ۱۰۶ =۲۸۸×۱۰۳/mL   

مثال سوم: نمونه‌ای را ۱/۲ رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام ۱۲۰ اسپرم را در کل ۹ مربع و در طرف دیگر ۱۴۰ اسپرم را در همین تعداد مربع شمارش نموده‌ایم. مجموع دو شمارش در ۱۸ مربع برابر ۲۶۰ و تفاوت آن‌ها ۲۰ می‌باشد که در محدوده خطای قابل قبول است. طبق فرمول تعداد اسپرم‌ها را محاسبه می‌کنیم:

چون درکل لام نئوبار کمتر از ۴۰۰ اسپرم را شمارش کرده‌ایم،با استفاده ازجدول ۲-۲ میزان خطا راگزارش می‌کنیم که برای ۲۶۰ اسپرم حدود ۶‌% است.

مثال چهارم: نمونه ای را ۱/۲ رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام ۱۰ اسپرم و در طرف دیگر ۸ اسپرم شمارش شده است. چون در کل ۱۸ مربع کمتر از ۲۵ اسپرم شمارش شده است، لذا غلظت اسپرم کمتر از ۵۶,۰۰۰ گزارش می‌شود. در ضمن در جواب بیمار ذکر می‌کنیم که «تعداد اسپرم مشاهده شده کمتر از مقداری است که بتوان جواب صحیح برای بیمار گزارش نمود.»

محاسبه تعداد کل اسپرم‌های مایع انزالی: از حاصل ضرب غلظت اسپرم در حجم مایع منی تعداد کل اسپرم‌های مایع انزالی به ‌دست می‌آید که نشان دهنده توانایی بیضه ها در تولید اسپرم است.

شمارش سلول‌های غیر اسپرم:

سلول‌های غیر اسپرم (سلول‌های زایا، گلبول‌های سفید و سلول‌های اپی‌تلیال) و نیز سرها یا دم‌های تک اسپرم ممکن است در مایع منی وجود داشته باشند. در صورتی‌که این سلول‌ها به تعداد زیاد در نمونه وجود داشته باشند، می‌توان همزمان با شمارش اسپرم در لام نئوبار آنها را نیز شمارش نمود، اما معمولا” رقتی که برای شمارش اسپرم استفاده می‌شود بیش از حدی است که بتوان این سلول‌ها را تعیین نمود. روش بهتر آن است که این سلول‌ها را در اسمیر رنگ شده محاسبه نماییم. برای این‌کار مجموعا” ۴۰۰ اسپرم را در لام رنگ شده می‌شماریم و تعداد سلول‌های گرد (N) را هم کنار آنها محاسبه می‌کنیم. با دانستن غلظت اسپرم‌ها بر حسب میلی‌لیتر (S) می‌توان از فرمول زیر تعداد سلول‌های گرد را در هر میلی‌لیتر محاسبه نمود:

C=Sx(N/40)

حساسیت روش: در صورتی که کمتر از ۴۰۰ اسپرم در لام دیده شود، خطا بیش از 5‌% خواهد بود. در این موارد با استفاده از جدول 2-۲ درصد خطا را گزارش می‌کنیم. در صورتی که کمتر از ۲۵ سلول گرد شمارش شود، ذکر این نکته در جواب بیمار ضروری است که «تعداد سلول‌های گرد شمارش شده کمتر از مقداری است که بتوان غلظت دقیق آنها را تعیین نمود.»

مثال اول: در یک شمارش ۲۰۰ تایی اسپرم، تعداد ۲۱ سلول گرد و در شمارش ۲۰۰ تایی دیگر، ۳۹ سلول گرد شمارش شده است. مجموع سلول‌های گرد ۶۰ و تفاوت آنها ۱۸ است. با توجه به جدول 5‌-‌۲‌ این میزان اختلاف بیش از حد مجاز است و لذا آزمایش باید تکرار شود.

مثال دوم: در یک شمارش ۲۰۰ تایی اسپرم، تعداد ۲۴ سلول گرد و در شمارش دیگر ۳۶ سلول گرد شمارش شده‌اند. حاصل جمع دو شمارش ۶۰ و اختلاف آنها ۱۲ است. با توجه به جدول ۵‌-‌۲‌ نتایج در محدوده قابل قبول است.

غلظت اسپرم‌های این فرد mL/۱۰۶×۷۰ بوده است. برای محاسبه غلظت سلول‌های گرد از فرمول زیر استفاده می‌کنیم:

 C = 70×۱۰۶ × ( ۴۰۰/۶۰) =۱۰.۵×۱۰۶/mL

در صورتی که کمتر از ۴۰۰ اسپرم شمارش شده بود، میزان خطا را برای ۶۰ سلول گرد با توجه به جدول ۲-۲ تعیین می‌ کردیم که حدوداً ۱۳‌% می‌باشد.

نکته: اگر غلظت سلول‌های گرد در مایع منی بیش از ۱۰۶ در میلی‌لیتر باشد، ماهیت آنها را باید دقیقاً تعیین نمود. برای این‌ کار از مارکرهای لکوسیتی (بخش ۲‌-‌۳‌) و یا فعالیت پراکسیدازی این سلول‌ها (بخش ۱۸‌-‌۲‌) استفاده می‌شود.

نکته: تعداد کل سلول‌های گرد در مایع منی را می‌توان از حاصل ضرب غلظت آنها در حجم مایع منی به دست آورد که می‌تواند نشانگر شدت وجود التهاب یا شرایط اسپرم‌ زایی بیمار باشد.