آنالیز اسپرم- 4

 

 

روش کار روتین برای شمارش اسپرم

در اکثر موارد رقت 5/1 یا 20/1رقت مناسبی بوده و با آن می‌توان 200 اسپرم را در یک یا چند مربع از لام نئوبار (مربع‌های 4 و 5 و 6) شمارش نمود. برای تعیین رقت مناسب، ابتدا یک لام مستقیم تهیه نموده و با بزرگنمایی 200 یا 400 تعداد اسپرم‌های هر میدان میکروسکوپی را می‌شماریم. در صورتی که در لام مستقیم هیچ اسپرمی دیده نشود، یک لام دیگر تهیه می‌کنیم.

نکته: اگر لام مستقیمی را با بزرگنمایی 400 بررسی کنیم ، هر میدان میکروسکوپی حدود 4 نانولیتر (nL) حجم خواهد داشت.اگر در این میدان میکروسکوپی 100 اسپرم دیده شود، در هر نانولیتر 25 اسپرم خواهیم داشت و در نتیجه تعداد اسپرم‌هاmL / 25×103  یاmL / 25 ×106 خواهد بود. البته این برآورد دقیق نیست و می‌تواند بین 30‌% تا 130‌% مقدار واقعی باشد.

در نمونه‌هایی که ویسکوزیته زیادی دارند،استفاده از ملانژور سفید برای رقیق کردن مایع منی باعث بروز خطا می‌شود. اگر در رقتی که تهیه شده تعداد کمی اسپرم دیده شد، نمونه‌ دیگری با رقت کمتر تهیه می‌کنیم و اگر تعداد اسپرم‌ها خیلی زیاد بود و اسپرم‌ها روی هم افتاده بودند، نمونه‌ دیگری با رقت بیشتر تهیه می‌کنیم .

a) روش رقیق کردن اسپرم

ـ در داخل دو لوله مقدار مورد نیاز از محلول رقیق‌‌کننده اسپرم (فیکساتیو) می‌ریزیم.

ـ نمونه را به خوبی مخلوط کرده و مقدار مورد نیاز از مایع منی را با سمپلر برمی‌داریم. اطراف سرسمپلر را تمیز کرده (بدون اینکه با سر آن تماس برقرار شود) و آن را داخل لوله حاوی محلول رقیق‌کننده خالی می‌کنیم. سمپلر را چند بار پر و خالی نموده تا نمونه کاملاً تخلیه شود.

ـ به روش ذکر شده در لوله‌ای دیگر نیز یک نمونه رقیق شده تهیه می‌کنیم.

ـ لوله اول را به مدت 10ثانیه با ورتکس مخلوط کرده و سریعاً 10µL از آن را برمی‌داریم.

ـ لامل نئوبار را روی لام نئوبار می‌گذاریم. برای اینکه لامل به خوبی روی لام بچسبد، بهتر است لبه‌های آن را کمی مرطوب کنیم. لام نئوبار دو قسمت برای شمارش دارد که هر طرف را با یکی از لوله‌های رقیق شده پر می‌کنیم.

ـ سر سمپلر را به کناره لامل چسبانده و آن را خالی می‌کنیم. باید توجه داشت که هنگام تخلیه لامل حرکت نکند و فضای زیر لامل نیز کمتر یا بیشتر از حد پر نشود.

ـ طرف دیگر لام نئوبار را هم با لوله دوم به روش فوق‌الذکر پر می‌کنیم.

ـ لامها را حداقل به مدت 4 دقیقه در یک محیط مرطوب (مثلاً داخل یک پلیت که حاوی قطعه‌ای کاغذ صافی مرطوب است) قرار می‌دهیم تا سلول‌ها ثابت شوند.

b) روش شمارش اسپرم:

شمارش اسپرم را در دو طرف لام نئوبار انجام می‌دهیم. اگر این جواب‌ها همخوانی داشته باشند، نتیجه را گزارش کرده و در غیر این صورت آزمایش را تکرار می‌کنیم. برای شمارش، مربع مرکزی (شماره 5) را انتخاب می‌کنیم. این مربع 5 ردیف افقی دارد که حجم هر ردیف 20 نانولیتر است. ابتدا از یک ردیف شروع می‌کنیم و اسپرم‌ها را می‌شماریم. این‌کار را آنقدر ادامه می‌دهیم تا 200 اسپرم شمارش شود. اگر در ردیف اول به عدد 200 نرسیدیم، ردیف‌های بعدی را می‌شماریم تا 200 اسپرم راشمارش نماییم. البته اگر در وسط یک ردیف به عدد 200 برسیم شمارش را تا انتهای آن ردیف ادامه می‌دهیم. تعداد ردیف‌ها و اسپرم‌های شمارش شده را یادداشت می‌کنیم (مثلاً 226 اسپرم در 4 ردیف) . مربع‌های 4 و 6 (دو طرف مربع مرکزی) نیز هر کدام 5 ردیف افقی دارند. اگر در کل مربع مرکزی نتوانستیم 200 اسپرم را بشماریم از مربع‌های 4 و 6 استفاده می‌کنیم و کل ردیف‌های شمارش شده را یادداشت می‌کنیم. وقتی شمارش تکمیل شد، به طرف دیگر لام نئوبار رفته و اسپرم‌ها را در همین تعداد ردیف می‌شماریم. تعداد اسپرم‌های شمارش شده در دو طرف لام را با هم جمع کرده و اختلاف آن‌ها را نیز حساب می‌کنیم. این اختلاف باید مساوی یا کمتر از مقدار قابل قبولی باشد که در جدول 4‌-‌2 آمده است. در صورتی که اختلاف بیشتر باشد، عمل رقیق‌ سازی و شمارش مجددا” تکرار می‌شود.

در صورتی که اختلاف دو شمارش در محدوده قابل قبول بود، از فرمول زیر تعداد اسپرم‌ها را محاسبه می‌کنیم:

106×ضریب رقت×    1/20  ×N/n  (C) =تعداد اسپرم‌ها در هر میلی‌لیتر

N عبارت است از تعداد کل اسپرم‌های شمارش شده در دو طرف لام نئوبار

nعبارت است از تعداد کل ردیف‌هایی که اسپرم‌هادر آن‌ها شمارش شده‌اند (در دو طرف لام نئوبار)

به دو مثال زیر توجه کنید:

مثال اول:نمونه ای را 1/20 رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار 201 اسپرم را در هفت ردیف شمرده‌ایم و در طرف دیگر 245 اسپرم را در همین تعداد ردیف شمارش نموده‌ایم. مجموع این دو شمارش 446 و اختلاف آنها 44 است. با توجه به جدول 4‌-‌2‌ این اختلاف بیش از محدوده قابل قبول بوده و لذا باید مجدداً نمونه را رقیق کرده و شمارش را تکرار نماییم.

مثال دوم: نمونه‌ای را رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار 220 اسپرم را در چهار ردیف شمارش کرده‌ایم و در طرف دیگر 218 اسپرم را در همین تعداد ردیف شمرده‌ایم. حاصل جمع این دو شمارش در هشت ردیف 438 و اختلاف آنها 2 می‌‌باشد. این اختلاف با توجه به جدول 4‌-‌2‌ در محدوده قابل قبول است. برای محاسبه غلظت اسپرم از رابطه زیر استفاده می‌کنیم:

C = 8 × 1/2 × 20 × 106 = 55×106 /mL

نکته: اگر در سه مربع 4 و 5 و 6 مجموعا”کمتر از 200 اسپرم شما رش شد، نباید از مربع‌های دیگر استفاده کرد زیرا حجم ردیف‌های این سه مربع با مربع‌های دیگر متفاوت است. در این موارد باید مجددا” نمونه ای با رقت کمتر تهیه نموده و شمارش را تکرار نماییم و یا حداقل میزان خطا را با توجه به جدول 2-2 برای پزشک گزارش نماییم.

مثال: نمونه‌ای را 1/20 رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار 98 اسپرم را در 15 ردیف (کل مربع‌های 4 و 5 و 6) و در طرف دیگر 114 اسپرم را در همین حجم شمارش کرده‌ایم. کار صحیح آن است که رقت را کمتر کرده و مجدداً شمارش را انجام دهیم، ولی اگر بخواهیم همین شمارش را ارائه کنیم به طریق زیر عمل می‌کنیم:

چون حاصل جمع 212 و اختلاف آنها 15 است، این اختلاف در حداقل قابل قبول است و لذا:

C = 212/30 × 1/20 × 20 × 106 = 7.1 × 106

با توجه به این، میزان خطا برای 212 اسپرم تقریباً برابر 7‌% می‌باشد.

مقادیر مرجع: کمترین حد مرجع برای غلظت اسپرم 106×15 در هر میلی‌لیتر است.

محاسبه تعداد کل اسپرم‌ها: از حاصل ضرب حجم مایع منی در غلظت اسپرم، تعداد کل اسپرم‌های یک فرد محاسبه می‌شود. این عدد بیانگر توانایی بیضه‌ها در تولید اسپرم است. کمترین حد مرجع برای تعداد کل اسپرمهای یک فرد 106×39 در هر انزال است.

کریپتوزواسپرمی Cryptozoospermia و آزواسپرمی  azoospermia

اگر در لام مستقیم هیچ اسپرمی دیده نشود، وجود آزواسپرمی محتمل است. زمانی می‌توان اصطلاح آزواسپرمی را به کار برد که در نمونه سانتریفوژ شده، مایع منی هیچ اسپرمی دیده نشود. با این حال شاید اطلاق واژه آزواسپرمی به سادگی امکان‌پذیر نباشد، زیرا حتی سانتریفوژ کردن در دور 3000 به مدت 15 دقیقه هم ممکن است برخی از اسپرم‌ها را رسوب ندهد ضمن اینکه کل رسوب را هم بررسی نمی‌کنیم و ممکن است در بخشی از رسوب که بررسی نشده اسپرمی وجود داشته باشد. با این حال وقتی در لام مستقیم اسپرمی دیده نشد، نمونه را 15 دقیقه در دور 3000 سانتریفیوژ می‌کنیم، محلول رویی را خالی کرده و رسوب را بررسی می‌کنیم. اگر اسپرمی دیده نشد، به آن آزواسپرمی می‌گوییم و اگر اسپرم دیده شد، اصطلاحاً به آن کریپتوزواسپرمی اطلاق می‌کنیم.

زمانی که در لام مستقیم با بزرگنمایی 400 تعداد کمی اسپرم دیده شود (0 تا 4)، تعداد اسپرم‌ها تقریباً کمتر از /mL 106×2 است. در برخی از موارد همین گزارش (علی‌رغم خطایی که دارد) برای ارزیابی بالینی بیمار کافی است، اما در حداکثر موارد باید تعداد دقیق اسپرم‌ها شمارش شود. برای این‌کار نمونه را به نسبت   1/2   رقیق می‌کنیم و هر 9 مربع بزرگ لام نئوبار را بررسی می‌کنیم تا 200 اسپرم شمارش شود. تعداد دقیق مربع‌هایی که در آن‌ها 200 اسپرم را شمرده‌ایم یادداشت نموده و در طرف دیگر لام نئوبار نیز این شمارش را انجام می‌دهیم. با استفاده از جدول 5‌-‌2‌ مشخص می‌نمائیم که آیا اختلاف دو شمارش در محدوده قابل قبول است یا خیر. اگر این اختلاف قابل قبول نبود، مجدداً آزمایش را تکرار کرده و در صورتی که قابل قبول باشد، غلظت را از فرمول زیر محاسبه می‌کنیم:

ضریب رقت   C = N/n × 1/100 × 106    

N= تعداد اسپرمهای شمارش شده

n = تعداد مربع‌هایی که شمارش در آنها انجام شده است

جدول 5‌–‌2‌ میزان اختلاف قابل قبول بین دو بار شمارش اسپرم در مواردی که تعداد اسپرم‌ها پایین است. اگرمجموعا” کمتر از 400 اسپرم در هر دو طرف لام نئوبار شمارش شود، با استفاده از جدول 2-2 میزان خطای کار را همراه نتیجه بیمار گزارش می‌کنیم. اگر رقت 1/2 باشد و کمتر از 25 اسپرم در هر طرف لام نئوبار شمارش شود، غلظت اسپرم کمتر از 56000 در میلی لیتر بوده ومیزان خطا 20% است (جدول 2-2).

دراین حالت ذکر جمله زیر درجواب بیمار ضروری است :

«تعداد اسپرم مشاهده شده کمتر از مقداری است که بتوان جواب صحیح برای بیمار گزارش نمود.»

به مثال‌های زیر توجه کنید:

مثال اول: نمونه‌ای را 1/2 رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار 200 اسپرم در دو مربع شمارش شده و در طرف دیگر 250 اسپرم را در همین تعداد مربع شمارش نموده‌ایم. مجموع دو شمارش در 4 مربع برابر با 450 و تفاوت آن‌ها 50 است. با توجه به جدول 5‌-‌2‌ این رقم بیش از اختلاف قابل قبول است و لذا باید مجددا” رقت تهیه کرده و آزمایش را تکرار کنیم.

مثال دوم: نمونه‌ای را رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام نئوبار 210 اسپرم در سه مربع شمارش شده و در طرف دیگر 200 اسپرم را در همین تعداد مربع شمارش نموده‌ایم. مجموع دو شمارش در 6 مربع برابر 410 و تفاوت آنها 10 است.

با توجه به جدول 5‌-‌2‌ این تفاوت قابل قبول است. برای محاسبه غلظت از رابطه زیر استفاده می‌کنیم:

C = 1/100 × 410/6 × 4×106= 2×106     

C = 1/100 ×  260/18 × 2 × 106 =288×103/mL   

مثال سوم: نمونه‌ای را 1/2 رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام 120 اسپرم را در کل 9 مربع و در طرف دیگر 140 اسپرم را در همین تعداد مربع شمارش نموده‌ایم. مجموع دو شمارش در 18 مربع برابر 260 و تفاوت آن‌ها 20 می‌باشد که در محدوده خطای قابل قبول است. طبق فرمول تعداد اسپرم‌ها را محاسبه می‌کنیم:

چون درکل لام نئوبار کمتر از 400 اسپرم را شمارش کرده‌ایم،با استفاده ازجدول 2-2 میزان خطا راگزارش می‌کنیم که برای 260 اسپرم حدود 6‌% است.

مثال چهارم: نمونه ای را 1/2 رقیق کرده‌ایم. در یک طرف لام 10 اسپرم و در طرف دیگر 8 اسپرم شمارش شده است. چون در کل 18 مربع کمتر از 25 اسپرم شمارش شده است، لذا غلظت اسپرم کمتر از 56,000 گزارش می‌شود. در ضمن در جواب بیمار ذکر می‌کنیم که «تعداد اسپرم مشاهده شده کمتر از مقداری است که بتوان جواب صحیح برای بیمار گزارش نمود.»

محاسبه تعداد کل اسپرم‌های مایع انزالی: از حاصل ضرب غلظت اسپرم در حجم مایع منی تعداد کل اسپرم‌های مایع انزالی به ‌دست می‌آید که نشان دهنده توانایی بیضه ها در تولید اسپرم است.

شمارش سلول‌های غیر اسپرم:

سلول‌های غیر اسپرم (سلول‌های زایا، گلبول‌های سفید و سلول‌های اپی‌تلیال) و نیز سرها یا دم‌های تک اسپرم ممکن است در مایع منی وجود داشته باشند. در صورتی‌که این سلول‌ها به تعداد زیاد در نمونه وجود داشته باشند، می‌توان همزمان با شمارش اسپرم در لام نئوبار آنها را نیز شمارش نمود، اما معمولا” رقتی که برای شمارش اسپرم استفاده می‌شود بیش از حدی است که بتوان این سلول‌ها را تعیین نمود. روش بهتر آن است که این سلول‌ها را در اسمیر رنگ شده محاسبه نماییم. برای این‌کار مجموعا” 400 اسپرم را در لام رنگ شده می‌شماریم و تعداد سلول‌های گرد (N) را هم کنار آنها محاسبه می‌کنیم. با دانستن غلظت اسپرم‌ها بر حسب میلی‌لیتر (S) می‌توان از فرمول زیر تعداد سلول‌های گرد را در هر میلی‌لیتر محاسبه نمود:

C=Sx(N/40)

حساسیت روش: در صورتی که کمتر از 400 اسپرم در لام دیده شود، خطا بیش از 5‌% خواهد بود. در این موارد با استفاده از جدول 2-2 درصد خطا را گزارش می‌کنیم. در صورتی که کمتر از 25 سلول گرد شمارش شود، ذکر این نکته در جواب بیمار ضروری است که «تعداد سلول‌های گرد شمارش شده کمتر از مقداری است که بتوان غلظت دقیق آنها را تعیین نمود.»

مثال اول: در یک شمارش 200 تایی اسپرم، تعداد 21 سلول گرد و در شمارش 200 تایی دیگر، 39 سلول گرد شمارش شده است. مجموع سلول‌های گرد 60 و تفاوت آنها 18 است. با توجه به جدول 5‌-‌2‌ این میزان اختلاف بیش از حد مجاز است و لذا آزمایش باید تکرار شود.

مثال دوم: در یک شمارش 200 تایی اسپرم، تعداد 24 سلول گرد و در شمارش دیگر 36 سلول گرد شمارش شده‌اند. حاصل جمع دو شمارش 60 و اختلاف آنها 12 است. با توجه به جدول 5‌-‌2‌ نتایج در محدوده قابل قبول است.

غلظت اسپرم‌های این فرد mL/106×70 بوده است. برای محاسبه غلظت سلول‌های گرد از فرمول زیر استفاده می‌کنیم:

 C = 70×106 × ( 400/60) =10.5×106/mL

در صورتی که کمتر از 400 اسپرم شمارش شده بود، میزان خطا را برای 60 سلول گرد با توجه به جدول 2-2 تعیین می‌ کردیم که حدوداً 13‌% می‌باشد.

نکته: اگر غلظت سلول‌های گرد در مایع منی بیش از 106 در میلی‌لیتر باشد، ماهیت آنها را باید دقیقاً تعیین نمود. برای این‌ کار از مارکرهای لکوسیتی (بخش 2‌-‌3‌) و یا فعالیت پراکسیدازی این سلول‌ها (بخش 18‌-‌2‌) استفاده می‌شود.

نکته: تعداد کل سلول‌های گرد در مایع منی را می‌توان از حاصل ضرب غلظت آنها در حجم مایع منی به دست آورد که می‌تواند نشانگر شدت وجود التهاب یا شرایط اسپرم‌ زایی بیمار باشد.