پيام بهزادي- عضو هيات علمی گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس
الهام بهزادي، لرنيک عيساخانيان-گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس 
Aspergillus: قارچ فرصتطلب با انتشار جهانی
Aspergillus، از گروه قارچ های رشته ای مهمی است. این قارچ انتشار جهانی داشته و به عنوان يک عامل عفونت زای فرصت طلب قارچی به شمار می رود. از 180 گونه ی شناخته شده ی اين قارچ، برخی سبب بروز حساسيت و يا عفونتهای مهاجم در انسان می شوند.
مهمترين گونه های عفونت زا در انسان عبارتند از:
Aspergillus fumigatus، Aspergillus flavus، Aspergillus terreus و Aspergillus niger.
کاربرد فناوری PCR در تشخیص قارچ Aspergillus
فناوری PCR (Polymerase Chain Reaction) مهم ترين روش تکثير اسيدهای نوکلئيک جهت تشخيص Aspergillus به شمار می آيد.
در آسپرجیلوزیس مهاجم، پژوهشگران اسیدهای نوکلئیک مربوط به گونههای عفونتزای قارچ Aspergillus را از طریق بررسی بخشهای مختلف نمونه خون (سرم، پلاسما و خون کامل) شناسایی میکنند. پژوهشگران بر سر این که کدام بخش از خون برای شناسایی DNA قارچ Aspergillus مناسبتر است به توافق نرسیدهاند.
همچنین پژوهشگران از روش PCR برای بررسی نمونههای بهدستآمده از مایعات حفرات برونشها و بافتها استفاده میکنند. البته شواهدی نشان میدهد که آزمایشگران میتوانند با استفاده از سرم خون، آزمون آنتیژن را نیز بهطور همزمان و بدون افزودن مواد ضدانعقاد انجام دهند.
چالشها و روشهای استخراج DNA قارچها با تأکید بر Aspergillus
بررسیها نشان میدهند که کیتهای تجاری کاراییهای متفاوتی در استخراج DNAدارند. ديواره ی سلولی قارچها يکی از بزرگترين موانع برای استخراج DNA با کيفيت بالا می باشد. يکی از روشهای استخراج DNA استفاده از پروتکلهای ويژه ی هر موسسه يا شرکت است. با استفاده از کيتهای تجاری و يا روشهای تجاری خودکار می توان به اين هدف دست يافت. روش های تجاری خودکار برای شناسايي DNA قارچی يک گزينه ی مهم به شمار می آيند.
بدين طريق میتوان روشهای تشخيصی بالينی رايج را مدرن و پيشرفته نمود. بررسی ها نشان می دهند که کارايي کيتهای تجاری برای استخراج DNA به طور چشمگيری از يکديگر متفاوتند. شکستن سريع سلول های قارچی با استفاده از واکنشگرهای تخريب کننده ی ساختار مولکولی و تجزيه کننده ی بستر بخش های مختلف سلول، کيفيت بالايي ازاين فرآيند DNA مربوط به گونههای مختلف قارچ Aspergillus و ساير قارچهای رشتهای را در اختيار پژوهشگران قرار میدهد. نکته ی مهم آن که، پروتکلهای مختلفی برای استخراج DNA وجود دارد و همچنين چگونگی انجام آنها مانع از مقايسه ی روشهای مولکولی تشخيصي با يکديگر می شوند.
پرایمرهای مولکولی در تشخیص قارچها
امروزه، متخصصان از روشهای مولکولی برای تشخيص عوامل عفونتزای قارچی در نمونههای بالينی استفاده میکنند. متخصصان تکنيکهای مزبور را به عنوان روشهای اختصاصی و تشخيصی نهايی بهکار میگيرند. برای دريافت پاسخ بهينه، متخصصان میبايستی از پرايمرهايي استفاده کنند که گسترهی وسيعی از توالیهای نوکلئوتيدی قارچها را در بر گرفته و بتوانند به کمک آن اقدام به شناسايی گونهی قارچی نيز نمايند.
پژوهشگران پرايمرهای قارچشمول را بر اساس بخش های محافظتشده طراحی میکنند؛ بخشهایی که توالیهای اختصاصی هر گونه را در خود جای میدهند. پژوهشگران کمپلکس DNA ریبوزومی را بهعنوان رایجترین بخش هدف انتخاب میکنند. این کمپلکس توالیهای محافظتشده و متغیر را در خود دارد، متغير بوده و در حال حاضر حجم بالایی از اطلاعات در مورد گستره ی وسيعی از جنسها و گونه های قارچی در پايگاههای داده ها وجود دارد. پژوهشگران ژنهای ميتوکندريايی کدکننده RNA و سيتوکروم b را به عنوان پرايمرهای هدف استفاده کردهاندو ژنهای هدف ميتوکندريايي را به عنوان کپیهای چندگانه در نظر میگیرند، زيرا به ازای هر هسته در يک سلول چندين ميتوکندری وجود دارد.
مقایسه Nested PCR و Real-Time PCR
در گذشته پژوهشگران از روش Nested PCR به عنوان مهمترين روش اختصاصی برای شناسايی گونههای مختلف قارچ Aspergillus استفاده میکردند. به دليل نياز به باز نمودن لوله های واکنش، رفته رفته ارزش و اهميت خود را از دست داد؛ زيرا با باز کردن در لوله های واکنش، امکان آلودگی نمونه ی مورد مطالعه وجود داشته و از اينرو، امروزه استفاده از روشهای Real-Time PCR جايگزين Nested PCR شده است.
تکنيکهای شناسايي بعد از تکثير، اين تکنيکها اطلاعات اختصاصی مربوط به جنس يا گونه را در اختيار پژوهشگران قرار میدهند. در عين حال ميزان اختصاصی و حساس بودن نيز افزايش می يابد. روشهای تشخيصي Real-Time PCR خودکار، سريع و قابل تکرار می باشند.
حساسيت يک آزمون مولکولی را، پژوهشگران با بررسی رقت سريال عامل عفونتزا تعيين میکنند. اين کار در مورد Aspergillus spp. و ديگر قارچهای رشته ای مشکل زا خواهد بود؛ چراکه تعيين رقت برای هيفهای قارچی بی معنا است. همچنين تهيه ی رقت سريال از کنيديوم و يا مولکولهای DNA (چه مولکولهای DNA ژنومی و چه مولکولهای DNA پلاسميدی) قارچهای رشته ای روشهای مناسبی نيستند.
ارزیابی حساسیت در تشخیص قارچها
کنيديوم ها روند زيستی مشابه با ساختار رويشی هيفها را از خود نشان نمی دهند، برای نمونه هيفهای قارچی برخلاف کنيديومها قادر به تهاجم می باشند. در مورد حالت دوم، درجه ی خلوص مولکولهای DNA استخراج شده، مورد بررسی قرار نمي گيرد.
برای شناسايي بيش از يک گونه ی قارچی، میبايستی مولکول های DNA قارچی با روش ارزشيابی ميزان حساسيت مورد تجزيه و تحليل قرار گيرند. اگرچه، آزمونهای تعيين حساسيت مزبور از جهات بسياری گوناگون و متفاوتند، ولی در بسياری از روش های گزارش شده 1 تا 10 قطعه از DNA به عنوان توالی هدف، مورد استفاده قرار می گيرند. البته، تنوع در محدوديتهای شناسايي اين امکان را به پژوهشگران می دهد تا بتوانند آزمون های ياد شده را مقايسه نمايند.
چالشهای طراحی پرایمر قارچی
بايستی توجه داشت که پژوهشگران تاکنون در آزمونهای بررسی ميزان حساسيت و اختصاصی بودن روشهای مولکولی مورد استفاده برای شناسايي قارچها از تکنيکها و سنجشهای استانداردی بهره نگرفتهاند. در حال حاضر، پژوهشگران پرايمرهای هدف را عموماً از منطبقسازی با توالیهای نوکلئوتيدی موجود در پايگاههای دادهها نظير آنچه که پایگاه NCBI به پژوهشگران ارائه میکند، میسازند. اگرچه انجام چنين کاری الزامی به نظر میرسد، ولی متخصصان چنين روندی را در عرصهی فعاليتهای پژوهشی ناکافی و ناقص ارزيابی میکنند
پژوهشگران بايد آمپليکون مورد نظر را توالیيابی کنند و توالیهای هدف را با استفاده از نرمافزارهای مربوطه مقايسه و ارزيابی نمايند. لازم است تا پژوهشگران شباهت توالیهای هدف را با توالیهای مشابه خود در موجودات زندهی ديگر مورد ارزيابی قرار دهند و مقايسه کنند. برای نمونه، در مورد قارچ Aspergillus، جنسهايی که قرابت فيلوژنتيکی به اين قارچ دارند مانند Penicillium و Paecilomyces را می بايستی مورد توجه قرار داد.
روشهای نوین تشخیص مولکولی
اما نکته ی مثبتی که در حال حاضر می تواند روند کاربرد روشهای مولکولي را افزايش دهد، استفاده از Uracil‑D‑Glycosylase از ايجاد واکنشهای مثبت دروغين در شناسايی قارچها جلوگيری میکند.
آنچه که حساس بودن روش PCR در شناسايي عوامل قارچی موجود در نمونه های بالينی را مورد ترديد قرار داده است، ويژگی بازدارندگی داروهای ضد قارچی برای PCR است، اما بايستی توجه داشت که با توجه به اين که متخصصان نشان دادهاند که استفاده از روش سنتی کشت قارچها با مشکلات غيرقابل تغييری همراه است و نيز درستی و سرعت بالايي که پژوهشگران در ارائهی پاسخ بسياری از آزمونهای PCR مشاهده میکنند، موجب شده تا استفاده از تکنيکهای مولکولی برای شناسايي عوامل عفونت زای ميکروبی در نمونه های بالينی به طور چشمگيری افزايش يابد. به علاوه، تکنيک ديگری که به تازگی در شناسايي عوامل عفونت زای ميکروبی در نمونه های بالينی و از جمله قارچها در دست بررسی بوده و سرعت تشخيص بالايي را ارائه می دهد، فناوری Micoarray می باشد که در آينده ی نزديک در سرتاسر جهان از جايگاه ويژه ای برخوردار خواهد شد.
منابع:
1)Hope W.W., Walsh T.J., Denning D.W., Laboratory Diagnosis of invasive Aspergillosis, Lancet infectDis (2005):609-22
2)Wengenak N.L., Binnicker M., Fungal Molecular Diagnostics, Clin Chest Med 30 (2009) 391-408
3)http://www.aspergillus.org.uk/, 2010-04-29
4)Singleton, P., Sainsbury, D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, John Wiley and Sons, edition 3r2002
