روش وسترن بلات يا ايمنو بلات

همان طوركه می دانیم در تكنیک ELISA پروتئینها در سطح حفرات پلیت پوشش داده می شوند و در انتهای آزمایش ELISA ، از یك واكنش رنگ زا برای شناسایی انجام واكنش یا عدم انجام آن استفاده می شود. اما در وسترن بلات ابتدا پروتئین توسط الكتروفورز روی ژل اكریل امید جدا شده، سپس توسط جریان الكتریكی به غشاء نیترو سلولوز انتقال داده می شوند. این غشاء شبیه به كاغذ معمولی است، اندازه حفرات آن كاملا مشخص است و توانایی زیادی در اتصال به پروتئین دارد. پس از اینكه پروتئین به غشاء نیتروسلولوز انتقال داده شد، بقیه مراحل شبیه به ELISA طی می شود، با این تفاوت كه مسیر حركت هر نمونه به شكل یك نوار بریده می شود و درون ظرف خاصی كه شیارهایی به اندازه نوار بریده شده، قرار می گیرد و بقیه مراحل در این ظرف انجام می گیرد . به این ترتیب به طور مثال اگر نمونه كشت ویروس HIV در اختیار داشته باشیم، باید ابتدا آنرا الكتروفورز نماییم. پس از الكتروفورز باندهای پروتئینی را به gp و 41 gp120 هر یك بنا به اندازه مولكول آنها، روی ژل تفكیك می شوند. اكنون باندهای پروتئین را به غشای نیترو سلولز انتقال داده تا مراحل بعدی به راحتی صورت گیرد .

پس از اینكه پروتئین ها به غشای نیترو سلولز منتقل شدند، مرحله بعدی می تواند به دو گونه طراحی شود :

الف) بعضی از مواقع هدف، شناسایی پروتئین خاص در پروتئین های الكتروفورز شده است. این حالت بیشتر در تحقیقات كاربرد دارد .
ب) در برخی موارد نیز مخلوط پروتئینی، ماهیت مشخصی دارد و حتی وزن مولكولی پروتئین های این مخلوط و موقعیت آنها پس از الكتروفورز مشخص می باشند. در این موارد می توان حضور آنتی بادی علیه پروتئین های را در سرم مورد آزمایش بررسی نمود. در اكثر موارد تشخیص از این روش استفاده می شود. به طور مثال پروتئین های ویروس HIV الكتروفورز شده، سپس به غشای نیتروسلولز منتقل می شود. اكنون پس از مجاورت با سرم انسانی هدف آزمایش، بررسی وجود آنتی بادی علیه پروتئین غشایی یا مركزی HIV است. در این مواقع علاوه بر حضور یا عدم حضور آنتی بادی اختصاصی می توانیم مشخص سازیم كه آنتی بادی فرد علیه چه جزئی از عامل بیماری زا است .
به این ترتیب موارد مثبت كاذب مشاهده شده در آزمون ELISA در اینجا حذف می شود و به طور اختصاصی واكنش دهی آنتی بادی، مورد آزمون قرار می گیرد. در بسیاری مواقع كه چندین بار (2 تا 3 بار) تست ELISA روی یك عامل عفونی خطرناك برای یك بیمار مثبت می گردد، جهت تایید تست الایزا از تست وسترن بلات استفاده می شود نظیر عفونت های HIV، HTLV و HSV . 
البته امروزه برای بسیاری از عفونت های ویروسی و باكتریایی تست تأیید وسترن بلات موجود است. به لحاظ تكنیكی در مواردی كه هدف ارزیابی حضور آنتی بادی خاص در یك سرم باشد، مراحل ذیل دنبال می شود تا اینكه در انتها از طریق واكنش رنگزایی رسوبی، اتصال آنتی بادی به آنتی ژن مشخص گردد. از آنجا كه جایگاه حركت و قرار گیری آنتی ژن روی نوار نیترو سلولز مشخص است، می توانیم مشاهده واكنش رنگی را دلیل بر اتصال آنتی بادی اختصاصی به آن آنتی ژن بدانیم.

1- الكترو فورز محلول پروتئین روی ژل پلی اكریل آمید در حضور سديم دو دسيل سولفات.
2– انتقال باندهای پروتئین جدا شده از ژل پلی آكریل آمید به كاغذ نیتروسلولز به وسیله جریان الكتریسیته.

 -3بریدن مسیر حركت پروتئین ها روی كاغذ نیترو سلولز به شكل نوار .

4– مجاور كردن این نوارها با موادی نظیر BSA2% یا شیر خشك بدون چربی تا اینكه سایر جایگاههای كاغذ نیترو سلولز پوشش داده شود و پروتئین های مراحل بعدی آزمایش به آن متصل نگردد. در مواردی كه از كیت های تجاری استفاده می شود ، معمولا” نوارهای بریده شده نیتروسلولز كه پروتئین ها به آن انتقال داده شده اند، به همراه الگوی قرارگیری پروتئین ها در كیت وجود دارد. این نوارها معمولا” مراحل بلكینگ را نیز پشت سر گذاشته اند.

5 –در این مرحله سرم مورد آزمایش با نوار نیترو سلولز مجاور می شود. مدت زمان مجاور سازی می تواند بین 1 تا 3 ساعت باشد.

6– پس از چند بار شستشو نوار نیترو سلولز (در همان شیارهای مربوطه ) آنتی بادی ضد ایمونو گلبولین انسانی كونژوگه شده با آنزیم (در صورتی كه نمونه سرم مربوط به انسان باشد) اضافه می شود و پس از ۲-۱ ساعت (همراه با حركت دادن ظرف) نوارها 3 تا 5 بار توسط بافر مخصوص شستشو می شوند.
7 –با ریختن سوبسترای آنزیم بر روی نوار، واكنش رنگی رسوبی در محل اتصال آنتی بادی ایجاد می شود كه می تواند نشانگر حضور آنتی بادی علیه آنتی ژن خاص باشد. نوع سوبسترای به كاررفته وابسته به آنزیمی است كه به انتهای آنتی بادی ضد ایمونوگلوبین انسانی متصل است. در مواردی كه این آنزیم  ‌Horse Radish Peroxdase باشد، سوبسترای بكار رفته می تواند دی- آمینو بنزیدین و H2O2 باشد كه آنزیم با اكسید كردن دی – آمینو بنزیدین ، رنگ قهوه ای تیره ای را در محل واكنش آنتی بادی – آنتی ژن رسوب می دهد.

بر گرفته از: كتاب روش های عملی در ایمنولوژی