آزمايش ميكروسكوپی نمونه های مدفوع

معمولا” آزمایش میكروسكوپی نمونه های مدفوع متشكل از سه مرحله جداگانه شامل :

 1. تهیه گسترش مستقیم ،

2. روشهای تغلیظ نمونه و

3. روشهای رنگ آمیزی دائمی می باشد كه به تدریج روشهای استاندارد مراحل فوق برای همكاران ارسال می گردد .

 

تهیه گسترش مستقیم ( مرطوب(
گسترش مستقیم را می توان در كوتاهترین مدت و با حداقل امكانات تهیه نمود.
در صورت مثبت بودن آن از نظر وجود انگل، می توان یك گزارش اولیه سریع به پزشك ارائه داد و گزارش نهایی را موكول به انجام آزمایش با استفاده از روشهای تلغیظ و رنگ آمیزی دائمی نمود.
در آزمایش مستقیم به علت برداشت حجم بسیار كمی از مدفوع، امكان دستیابی به انگل خیلی كم است. همچنین در صورت یافتن انگل، به علت اینكه بعضی از تك یاخته ها خیلی كوچك می‌باشند به سختی می توان در گسترش مستقیم نوع آنها را تعیین نمود .

اهداف تهیه گسترش مستقیم  

 -1ارزیابی میزان آلودگی بیمار
2- تشخیص سریع نمونه هایی كه آلودگی شدید دارند
3- بررسی حركت ارگانیسم می باشد

این روش آماده سازی باید بر روی نمونه های تازه مدفوع كه در یخچال نگهداری نشده و یا با مواد نگهدارنده مخلوط نگردیده است، انجام گیرد. در این روش ، مراحل مختلف زندگی اغلب انگلهای روده ای ( تروفوزوئیت، كیست، لارو و تخم )، اووسیست كوكسیدیاها، اجسام كروماتوئید موجود در كیست و حركت تروفوزوئیت ها را می توان تشخیص داد.
در مورد نمونه های تازه ای كه در ماده نگهدارنده قرار داده نشده اند، محلول ۸۵% كلرورسدیم در آب و یا محلول ید به عنوان رقیق كننده استفاده می شود. برای نمونه های نگهداری شده در فرمالین و یا مواد نگهدارنده دیگر، مواد نگهدارنده نقش رقیق كننده را نیز ایفا می كنند.
باید توجه نمود كه ید و مواد نگهدارنده مانند فرمالین باعث كشته شدن ارگانیسم شده و حركت آن را نمی توان بررسی نمود.
تهیه گسترش مستقیم با محلول ید باعث می شود كه هسته و بیشتر عناصر داخل كیستهای انگل مشخص گردند. معمولا” در این گونه آماده سازی ، تروفوزوئیت ها شكل طبیعی خود را از دست می دهند. تخم كرمها و لاروها قابل شناسایی هستند، اما بعضا” جزئیات داخلی آنها نامشخص می شود. برای تشخیص اولیه اووسیست كریپتوسپوریدیوم تهیه نمونه با محلول ید پیشنهاد می گردد، زیرا معمولا” اووسیستها ید را جذب نكرده و شفاف می مانند) بر خلاف مخمرها و دیگر عناصر مدفوع كه رنگ زرد ید را جذب می نمایند)، اما به هر حال باید تشخیص قطعی كریپتوسپوریدیوم با رنگ آمیزیهای اختصاصی و یا استفاده از كیت دارای آنتی بادی منوكلونال اختصاصی انجام گیرد .
اووسیست ایزوسپورابلی نیز می تواند در گسترش مستقیم دیده شود . اسپورهای میكروسپوریدیا آنقدر كوچك هستند كه ممكن است با ذره های كوچك موجود در محیط اشتباه شوند ، بنابراین در گسترش مستقیم ممكن است تشخیص صحیح داده نشوند.

در امتحان میكروسكوپی نمونه مدفوع ممكن است عناصر زیر دیده شوند :
 -1 ترفوزوئیت و كیست تك یاخته های روده ای
2- اووسیست كوكسید یا و اسپورهای میكرسپوریدیا كه تشخیص این اسپورها از ذره های كوچك موجود در محیط مشكل است .
 -3تخم كرمها و لاروها
4- گلبولهای قرمز كه ممكن است دلیل زخم یا عوامل دیگر خونریزی دهنده باشد .
5- گلبولهای سفید مخصوصا” نوتروفیلها كه ممكن است دلیل التهاب باشد .
 -6ائوزینوفیلها كه معمولا” دلیل وجود یك پاسخ ایمنی است ( كه ممكن است در ارتباط با وجود عفونتهای انگلی و یا علل دیگر باشد( .
7- ماكروفاژها كه ممكن است به دلیل حضور عفونتهای باكتریایی یا انگلی باشد .
-8كریستالهای شاركوت لیدن كه بقایای ائوزینوفیلهای تخریب شده است (ممكن است در ارتباط با وجود عفونتهای انگلی و یا علل دیگر باشد( .
 -9قارچها ( انواع كاندیدا ) و مخمرهای دیگر و یا قارچهای شبه مخمر .
 -10سلولهای گیاهی ، دانه های گرده و اسپورهای قارچها كه ممكن است شبیه تخم كرمها، كیست تك یاخته ها و اووسیست كوكسیدیا و اسپورهای میكروسپوریدیا باشد .
-11  فیبر یا ریشه گیاهان و یا موی حیوانات كه ممكن است شبیه لارو كرمها باشد .

تهیه محلول سرم فیزیولوژی
1–  0.85 گرم كلرورسدیم (Nacl ) را در 100 میلی لیتر آب مقطر به خوبی حل كنید .
به میزان 10 میلی لیتر به داخل 10 لوله در پیچ دار بریزید . لوله ها را در دمای C121 به مدت 15 دقیقه اتوكلاو نمائید و بعد از سردشدن در یخچال C4 نگهداری كنید. ( در صورت در دسترس نبودن لوله در پیچ دار پس از استریل نمودن، می توان جهت جلوگیری از تبخیر محلول، در لوله را با پارافیلم كاملا” ببندید ) روی برچسب لوله نام محلول و تاریخ انقضای آن را به مدت حداكثر یك سال بعد از تاریخ ساخت بنویسید .
تهیه محلول iodine‘Anton’D
مواد لازم :
1- یدور پتاسیم  Potassuim iodide = k1) گرم یک گرم)
2- كریستال ید پودر شده ( Iodine crystals ) 5 گرم
 -3آب مقطر تا 100 میلی لیتر

یدور پتاسیم و كریستالهای ید را در آب مقطر حل كنید . ( مقدار اضافی كریستالهای حل نشده ید در ته ظرف باقی می ماند كه به دلیل وجود این كریستالها، محلول ذخیره در مدت زمان طولانی، دارای كیفیت مطلوب می باشد. بنابراین محلول را صاف ننمائید.(
محلول فوق را در شیشه قهوه ای رنگ ریخته و در محل تاریك، در حرارت اطاق نگهداری نمائید. این محلول جهت استفاده فوری بكار می رود، بنابراین مقداری از آن را به عنوان محلول كاری در دسترس قرار دهید. رنگ محلول كاری باید شبیه چای پر رنگ باشد و چنانچه در مدت 14- 10 روز رنگ آن روشن تر گردد، باید دور ریخته شود.
روی برچسب شیشه محتوی محلول ذخیره، نام محلول و تاریخ انقضای آن را به مدت حداكثر یكسال بعد از تاریخ ساخت بنویسید.

تهیه محلول لوگل ( Lugols iodine )
مواد لازم :
1- یدور پتاسیم 10 گرم،
-2 كریستال ید پودر نشده 5 گرم،
3 –آب مقطر 100 میلی متر
)مراحل اشاره شده در مورد تهیه محلول ید و این محلول مشابه است(

جهت ساخت محلول كاری از محلول ذخیره به نسبت 1:5 آن را با آب مقطر رقیق نموده و داخل شیشه قهوه ای رنگ ( قطره چكان ) نگهداری می نمائیم.