Aspergillus spp.روشهای مولکولی تشخيصی
پيام بهزادي- عضو هيات علمی گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس
الهام بهزادي، لرنيک عيساخانيان-گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس
Aspergillus، از گروه قارچهای رشته ای مهمی است که انتشار جهانی داشته و به عنوان يک عامل عفونت زای فرصت طلب قارچی به شمار می رود. از 180 گونه ی شناخته شده ی اين قارچ، برخی سبب بروز حساسيت و يا عفونتهای مهاجم در انسان می شوند. مهمترين گونه های عفونت زا در انسان عبارتند از: Aspergillus fumigatus، Aspergillus flavus، Aspergillus terreus و Aspergillus niger.
فناوری PCR (Polymerase Chain Reaction) مهمترين روش تکثير اسيدهای نوکلئيک جهت تشخيص Aspergillus به شمار می آيد.
بررسیها نشان می دهند که در آسپرجيلوزيز مهاجم، شناسايي اسيدهای نوکلئيک مربوط به گونه های عفونت زای قارچ Aspergillus از طريق مطالعه ی بخشهای مختلف نمونه ی خون (سرم، پلاسما و خون کامل) انجام می گيرد؛ اما هنوز اتفاق نظری در مورد اين که کدام بخش از خون برای شناسايي DNA قارچ Aspergillus بهتر است، وجود ندارد. همچنين، از روش PCR برای بررسی نمونه های بدست آمده از مايعات حفرات برونشها و بافتها استفاده می گردد. البته شواهدی وجود دارد که نشان می دهد با استفاده از سرم خون می توان به صورت همزمان آزمون آنتی ژن را نيز بدون اضافه نمودن مواد ضد انعقاد انجام داد. از مواد ضد انعقاد می توان به سيترات سديم، EDTA و هپارين اشاره نمود که از بازدارنده های PCR به شمار می آيند.
در حال حاضر روشهای متعددی برای استخراج DNA وجود دارد. ديواره ی سلولی قارچها يکی از بزرگترين موانع برای استخراج DNA با کيفيت بالا می باشد. يکی از روشهای استخراج DNA استفاده از پروتکلهای ويژه ی هر موسسه يا شرکت است. علاوه بر اين، با استفاده از کيتهای تجاری و يا روشهای تجاری خودکار می توان به اين هدف دست يافت. روش های تجاری خودکار برای شناسايي DNA قارچی يک گزينه ی مهم به شمار می آيند؛ زيرا بدين طريق میتوان روشهای تشخيصی بالينی رايج را مدرن و پيشرفته نمود. بررسیها نشان می دهند که کارايي کيتهای تجاری برای استخراج DNA به طور چشمگيری از يکديگر متفاوتند. شکستن سريع سلولهای قارچی با استفاده از واکنشگرهای تخريب کننده ی ساختار مولکولی و تجزيه کننده ی بستر بخشهای مختلف سلول، کيفيت بالايي از DNA مربوط به گونه های مختلفی از قارچAspergillus و ساير قارچهای رشته ای را در اختيار می گذارد. نکته ی مهم آن که، پروتکلهای مختلفی برای استخراج DNA وجود دارد و همچنين چگونگی انجام آنها مانع از مقايسه ی روشهای مولکولی تشخيصي با يکديگر می شوند.
امروزه، استفاده از روشهای مولکولی برای تشخيص عوامل عفونت زای قارچی در نمونه های بالينی از اهميت زيادی برخوردار می باشد، زيرا تکنيکهای مزبور به عنوان روشهای اختصاصی و تشخيصی نهايی به کار گرفته مي شوند. بنابراين، برای دريافت پاسخ بهينه، می بايستی از پرايمرهايي استفاده کرد که گستره ی وسيعی از توالیهای نوکلئوتيدی قارچها را در بر گرفته و بتوان به کمک آن اقدام به شناسايي گونه ي قارچی نيز نمود. پرايمرهای قارچ شمول، معطوف به بخشهای محافظت شده بوده که توالیهای خاص هر گونه را شامل می گردد. کمپلکس DNA ريبوزومی در قارچها، رايج ترين بخش هدف به شمار مي آيد. اين کمپلکس در بر دارنده ی تواليهای محافظت شده و متغير بوده و در حال حاضر حجم بالایی از اطلاعات در مورد گستره ی وسيعی از جنسها و گونه های قارچی در پايگاههای داده ها وجود دارد. ژنهای ميتوکندريايي کدکننده ی برخی از ژنهای RNA و سيتوکروم b نيز به عنوان پرايمرهای هدف مورد استفاده قرار گرفته اند. ژنهای هدف ميتوکندريايي به عنوان کپی های چندگانه در نظر گرفته می شوند، زيرا به ازای هر هسته در يک سلول چندين ميتوکندری وجود دارد.
در گذشته روش Nested PCR، به عنوان مهمترين روش اختصاصی برای شناسايي گونه های مختلف قارچ Aspergillus مورد استفاده قرار می گرفت، ولی به دليل نياز به باز نمودن لوله های واکنش، رفته رفته ارزش و اهميت خود را از دست داد؛ زيرا با باز کردن در لوله های واکنش، امکان آلودگی نمونه ی مورد مطالعه وجود داشته و از اينرو، امروزه استفاده از روشهای Real-Time PCR جايگزين Nested PCR شده است.
تکنيکهای شناسايي بعد از تکثير، اطلاعات اختصاصی مربوط به جنس يا گونه را بدست می دهند، ولی در عين حال ميزان اختصاصی و حساس بودن نيز افزايش می يابد. روشهای تشخيصي Real-Time PCR خودکار، سريع و قابل تکرار می باشند.
معمولا حساسيت يک آزمون مولکولی از طريق بررسی رقت سريال عامل عفونت زا تعيين می گردد، اما اين کار در مورد Aspergillus spp. و ديگر قارچهای رشته ای مشکل زا خواهد بود؛ چراکه تعيين رقت برای هيفهای قارچی بی معنا است. همچنين تهيه ی رقت سريال از کنيديوم و يا مولکولهای DNA (چه مولکولهای DNA ژنومی و چه مولکولهای DNA پلاسميدی) قارچهای رشته ای روشهای مناسبی نيستند. در مورد حالت نخست، چون کنيديومها روند زيستی مشابه با ساختار رويشی هيفها را از خود نشان نمی دهند، برای نمونه هيفهای قارچی برخلاف کنيديومها قادر به تهاجم می باشند. در مورد حالت دوم، درجه ی خلوص مولکولهای DNA استخراج شده، مورد بررسی قرار نمي گيرد.
برای شناسايي بيش از يک گونه ی قارچی، میبايستی مولکولهای DNA قارچی با روش ارزشيابی ميزان حساسيت مورد تجزيه و تحليل قرار گيرند. اگرچه، آزمونهای تعيين حساسيت مزبور از جهات بسياری گوناگون و متفاوتند، ولی در بسياری از روشهای گزارش شده 1 تا 10 قطعه از DNA به عنوان توالی هدف، مورد استفاده قرار می گيرند. البته، تنوع در محدوديتهای شناسايي اين امکان را به پژوهشگران می دهد تا بتوانند آزمونهای ياد شده را مقايسه نمايند.
از طرف ديگر، بايستی توجه داشت که تاکنون در آزمونهای بررسی ميزان حساسيت و اختصاصي بودن روشهای مولکولی مورد استفاده برای شناسايي قارچها از تکنيکها و سنجش های استانداردی بهره گرفته نشده است. در حال حاضر، پرايمرهای هدف عموما” از منطبق سازی با توالیهای نوکلئوتيدی موجود در پايگاههای داده ها نظير آنچه که در NCBI به پژوهشگران ارائه می گردد، ساخته می شود. اگرچه انجام چنين کاری الزامی به نظر می رسد، ولی چنين روندی در عرصه ی فعاليتهای پژوهشی ناکافی و ناقص ارزيابی می گردد. برای ساخت پرايمرهای مورد استفاده جهت شناسايي قارچهای مورد مطالعه، میبايستی آمپليکون مورد نظر توالیيابی شده و با استفاده از نرم افزارهای مربوطه نظير BLAST توالیهای هدف مورد مقايسه و ارزيابی قرار گيرند. علاوه بر اين، لازم است تا شباهت تواليهای هدف با تواليهای مشابه خود در موجودات زنده ی ديگر مورد ارزيابی قرار گرفته و مقايسه شوند. برای نمونه، در مورد قارچ Aspergillus، جنسهايی که قرابت فيلوژنتيکی به اين قارچ دارند مانند Penicillium و Paecilomyces را می بايستی مورد توجه قرار داد.
اما نکته ی مثبتی که در حال حاضر می تواند روند کاربرد روشهای مولکولي را افزايش دهد، استفاده از Uracil-D-Glyculase است که مانع از بروز واکنشهای مثبت دروغين در شناسايي قارچها می گردد.
آنچه که حساس بودن روش PCR در شناسايي عوامل قارچی موجود در نمونه های بالينی را مورد ترديد قرار داده است، ويژگی بازدارندگی داروهای ضد قارچی برای PCR است، اما بايستی توجه داشت که با توجه به اين که امروزه برای بسياری از متخصصين ثابت شده است که مشکلات غيرقابل تغييری در استفاده از روش سنتی کشت قارچها وجود داشته و نيز درستی و سرعت بالايي که در ارائه ی پاسخ بسياری از آزمونهای PCR مشاهده می شود، موجب شده تا استفاده از تکنيکهای مولکولی برای شناسايي عوامل عفونت زای ميکروبی در نمونه های بالينی به طور چشمگيری افزايش يابد. به علاوه، تکنيک ديگری که به تازگی در شناسايي عوامل عفونت زای ميکروبی در نمونه های بالينی و از جمله قارچها در دست بررسی بوده و سرعت تشخيص بالايي را ارائه می دهد، فناوری Micoarray می باشد که در آينده ی نزديک در سرتاسر جهان از جايگاه ويژه ای برخوردار خواهد شد.
منابع:
1)Hope W.W., Walsh T.J., Denning D.W., Laboratory Diagnosis of invasive Aspergillosis, Lancet infectDis (2005):609-22
2)Wengenak N.L., Binnicker M., Fungal Molecular Diagnostics, Clin Chest Med 30 (2009) 391-408
3)http://www.aspergillus.org.uk/, 2010-04-29
4)Singleton, P., Sainsbury, D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, John Wiley and Sons, edition 3r2002